1例crigler-najiar綜合征患者ug1a1基因突變分析

1例crigler-najiar綜合征患者ug1a1基因突變分析

criger-najjar綜合征（cn）顯示高非結(jié)合膽紅素血癥。根據(jù)膽紅素代謝障礙嚴(yán)重程度,一般將CN分為Ⅰ型和Ⅱ型。I型為UGT完全缺乏,常在出生后2年內(nèi)死于核黃疸;Ⅱ型為UGT表達(dá)功能部分缺乏,患者的預(yù)后雖然也差,但可生存至成年。CN的遺傳缺陷在于肝細(xì)胞缺乏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT),從而部分或完全不能將自循環(huán)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素,從肝臟排泄至腸道?，F(xiàn)已明確,CNⅡ型的遺傳方式為常染色體隱性遺傳,疾病的本質(zhì)為位于2q37上的基因UGT1A1基因異常。國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)近20個(gè)UGT1A1基因突變位點(diǎn)與CNⅡ有關(guān)。國(guó)內(nèi)尚無(wú)UGT1A1基因突變的家系報(bào)道。我們對(duì)國(guó)內(nèi)1例CNⅡ患者及其家系成員作了隨訪調(diào)查,并進(jìn)行了UGT1A1基因突變檢測(cè),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1數(shù)據(jù)和方法1.1入院時(shí)病情觀察及調(diào)查男性患者,23歲,未婚,農(nóng)民,安徽巢湖地區(qū)人。自幼即有黃疸,但發(fā)育、智力、身高正常,體重和體力等均正常。患者既往無(wú)酗酒、無(wú)嗜肝病毒性肝炎接觸感染、無(wú)特殊用藥史。無(wú)遺傳性疾病家族史。父母身體健康,否認(rèn)近親結(jié)婚。患者在5歲以后黃疸明顯,但有波動(dòng),表現(xiàn)為勞累、饑餓或感染時(shí)鞏膜黃染加深?；颊呒韧∈分谐烁喂δ軝z查顯示血清非結(jié)合膽紅素增高以外,其它生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。甲、乙、丙、丁、戊型等嗜肝病毒標(biāo)志物均陰性。B超檢查所示的肝、膽、胰聲像正常?；颊呷朐汉笮胁∈凡杉腕w格檢查,作了紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)、低熱卡試驗(yàn)及苯巴比妥誘導(dǎo)治療和肝組織活檢病理等檢查。在排除溶血性黃疸、嗜肝病毒感染等可能后,確診為CNⅡ。征得患者及其家系成員的同意并簽署同意書(shū),對(duì)該患者的有關(guān)家系成員作了調(diào)查。調(diào)查對(duì)象包括患者本人在內(nèi)的一、二、三級(jí)親屬共11人。1.2儀器、試劑和儀器OLYMPUSAU600全自動(dòng)生化分析儀(OLYMPUS公司,日本);DNeasyTissueKitsDNA提取盒(QIAGEN公司,美國(guó));UGT1A1外顯子7對(duì)寡核苷酸引物(英俊生物技術(shù)有限公司合成,上海);PTC-100型熱循環(huán)儀(MJ公司,美國(guó));FR-980紫外透射分析儀(上海復(fù)日公司,上海);ABIPRISMTM3700自動(dòng)激發(fā)熒光DNA測(cè)序儀(PE公司,美國(guó));三磷酸脫氧核苷(dNTP,IN-SITE生物有限公司,上海);DNA聚合酶(Hotstar酶,QIAGEN公司,美國(guó))等。1.3ugt11的分子遺傳分析1.3.1dna的提取患者及其家系成員11例對(duì)照者抽取外周靜脈血5ml,以1:10的3.8%枸椽酸抗凝,經(jīng)Ficollhypaque分離單個(gè)核細(xì)胞后,參照QIAGEN公司DNeasyTissueKits中的DNA提取方法,提取患者及其家系成員的全血白細(xì)胞基因組DNA,-20℃保存基因組DNA。1.3.2r-pcr反應(yīng)根據(jù)人類基因文庫(kù)數(shù)據(jù),采用Primer3.0軟件,設(shè)計(jì)人UGT1A1基因序列中第1～5外顯子的全部7對(duì)引物(表1)。此7對(duì)引物委托上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。PCR總反應(yīng)體積15μL,10倍緩沖液1.5μL,10mM三磷酸脫氧核苷(dNTP)0.3μl,引物0.4μL(正向、反向引物各0.2μL),DNA模板1.5μL,Hotstar聚合酶0.1μL,25mMMgCl20.8μL,加雙蒸水10.9μL。反應(yīng)條件為95℃變性15min進(jìn)入循環(huán);95℃30s,退火30s,其退火溫度外顯子1和5的第1部分為50℃,外顯子1和5的第2部分為64℃,外顯子2、3、4分別為60℃,52℃,52℃;72℃延伸30s。共35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5min。1.3.3瓊脂糖凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物4.0μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析,加溴乙錠1.0μL在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,于紫外線檢測(cè)儀上觀察DNA電泳條帶,并用成像系統(tǒng)攝影,使用SmartView軟件分析。pBR322DNA/HaeⅢ作為標(biāo)準(zhǔn)分子量。1.3.4生物技術(shù)有限公司取剩余擴(kuò)增產(chǎn)物11.0μL,進(jìn)行克隆及DNA測(cè)序(上海博亞生物技術(shù)有限公司)。測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中UGT1A1基因序列進(jìn)行對(duì)照,使用Sequencher4.2軟件分析DNA測(cè)序結(jié)果,根據(jù)各UGT1A1基因堿基波形來(lái)判斷基因突變位點(diǎn)。1.4外周血靜脈血中dna和基因的檢測(cè)家系材料的收集采用問(wèn)卷調(diào)查,內(nèi)容包括性別、年齡、是否近親婚配、健康狀況、有無(wú)慢性肝病、有無(wú)遺傳疾病史和既往肝功能檢查膽紅素水平等。隨后,我們對(duì)上述所有家系成員采集外周靜脈血5ml,進(jìn)行血清總膽紅素、非結(jié)合膽紅素和結(jié)合膽紅素等肝功能檢測(cè)并且用作提取DNA和基因檢測(cè)。全部家系成員DNA測(cè)序分析完成以后,以每個(gè)家系成員有否存在UGT1A1基因突變,按遺傳作圖方法表記出存在突變的家系成員的位置,并且根據(jù)是否出現(xiàn)膽紅素代謝障礙的表現(xiàn),標(biāo)記出隱性或顯性遺傳,從而找出突變基因的來(lái)源與遺傳方式。2結(jié)果2.1血清非結(jié)合激素低熱卡試驗(yàn)結(jié)果顯示,24h內(nèi)攝入熱量限為400kcal(97g葡萄糖)后,患者血清總膽紅素由原96.19μmol·L-1增高至247.2μmol·L-1,非結(jié)合膽紅素為243.5μmol·L-1而結(jié)合膽紅素僅3.7μmol·L-1接著,患者接受本巴比妥試驗(yàn)治療,劑量為60mg,每天3次口服,6d后血清非結(jié)合膽紅素測(cè)定值為27.8μmol·L-1。2.2大量色素顆粒和竇周隙內(nèi)的纖維增強(qiáng)肝臟活組織檢查(電鏡)見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)有大量色素顆粒,肝細(xì)胞間隙增寬,在增寬的間隙和竇周隙內(nèi)有膠原纖維增生,部分毛細(xì)膽管管腔擴(kuò)張,微絨毛變短或減少。2.3家庭研究系成員血清膽紅素檢查結(jié)果先證者表現(xiàn)典型的CNII,血清非結(jié)合膽紅素顯著升高,結(jié)合膽紅素正常,其余10例家系成員無(wú)臨床表現(xiàn),血清膽紅素均正常(表2)2.4dna電泳檢測(cè)受檢的CNⅡ先證者及其家系成員基因組DNA經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增,7對(duì)引物分別獲得包含UGT1A1基因序列第1～5外顯子的7個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物,取擴(kuò)增產(chǎn)物加溴乙錠1.0μL在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,于紫外線檢測(cè)儀上觀察DNA電泳條帶并用成像系統(tǒng)攝影。Ex1N1、Ex1N2、Ex2、Ex3、Ex4、Ex5N1、Ex5N2擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度與pBR322DNA/HaeⅢ標(biāo)準(zhǔn)分子量比較,擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度與表1所列一致。2.5tyr493基因的突變將他們的UGT1A1基因測(cè)序波形進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)患者以及5例家系成員的UGT1A1基因的第5外顯子序列的第486密碼子發(fā)生了堿基T→G錯(cuò)義突變,導(dǎo)致了酪氨酸(Tyr)變?yōu)樘扉T冬氨酸(Asp),命名為Tyr486Asp突變(圖1～4)。2.6未發(fā)病家系成員家系代碼根據(jù)測(cè)序結(jié)果,判定患者(家系代碼Ⅲ2)為該突變的純合子,6名未患病家系成員(家系代碼Ⅰ1,Ⅰ2,Ⅰ3,Ⅱ3,Ⅱ4,Ⅲ3)為該突變的雜合子;而在其余4名未患病家系成員(家系代碼Ⅰ4,Ⅱ,Ⅱ2,Ⅲ1)均未發(fā)現(xiàn)以上突變。遺傳作圖顯示,該CNⅡ家系的疾病遺傳方式符合常染色體隱性遺傳(圖5)。3尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因ty4底物突變本例Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型患者具有該病的全部特征?；颊叩难宸墙Y(jié)合膽紅素水平超過(guò)6倍正常水平,這是區(qū)別于Gilbert綜合征的一個(gè)重要指標(biāo);另一方面,膽紅素水平又低于正常25倍,這是與Crigler-Najjar綜合征I型的不同所在?；颊吣苌娴角嗄陼r(shí)期。值得注意的是,低熱卡試驗(yàn)和口服苯巴比妥誘導(dǎo)試驗(yàn)的結(jié)果具有重要價(jià)值。在前者,經(jīng)限制熱量攝入以后,患者血清總膽紅素在24h內(nèi)從96.19μmol·L-1升高至247.2μmol·L-1,非結(jié)合膽紅素為243.5μmol·L-1總膽紅素的98.5%,而結(jié)合膽紅素僅3.7μmol·L-1。結(jié)合膽紅素的這種特征性變化,在Gilbert綜合征是不可能出現(xiàn)的。在后者,口服苯巴比妥誘導(dǎo)試驗(yàn)治療6d后,患者血清的非結(jié)合膽紅素測(cè)定值降至27.8μmol·L-1者膽紅素代謝障礙的波動(dòng)性表現(xiàn).強(qiáng)烈提示非結(jié)合膽紅素在肝細(xì)胞內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程受著饑餓、某些藥物等外界因素的調(diào)控。以此可以推斷,代謝膽紅素的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的某些具有調(diào)控功能的元件出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)異常。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)的這例GNⅡ患者表現(xiàn)為UGT1A1基因第5外顯子序列的第486位密碼子發(fā)生了堿基T→G錯(cuò)義突變,即Tyr486Asp,并且為單一錯(cuò)義突變純合子。盡管文獻(xiàn)中有不少CNⅡ患者及其家系的研究,但尚未見(jiàn)到相同突變類型的報(bào)道。本例CNⅡ患者與其他家族成員相比較,臨床表型存在差異,僅突變純合子具有CNⅡ的典型臨床表型,相比之下,該家系中其余5例突變雜合子的成員無(wú)高非結(jié)合膽紅素血癥,而且4名正?；蛐蛄械某蓡T均未發(fā)病。家系遺傳圖譜分析顯示,Tyr486Asp突變的遺傳規(guī)律符合常染色體隱性遺傳。因此,UGT1A1基因Tyr486Asp突變被認(rèn)為是本例CNII家系的致病原因。不同人種、種族以及不同家系的CNⅡ存在不同的UGT1A1基因突變位點(diǎn)。這些不同突變位點(diǎn)對(duì)患者膽紅素代謝水平的影響不盡相同。就本例CNⅡ而言,患者血中非結(jié)合膽紅素的水平表現(xiàn)有波動(dòng)性改變。例如,患者的黃疸可以因饑餓、疲勞等因素加重,低熱卡試驗(yàn)陽(yáng)性,尤其是對(duì)苯巴比妥誘導(dǎo)試驗(yàn)治療反應(yīng)