多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型基因突變1例

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型基因突變1例

一條規(guī)律的腺瘤（m1）是一種罕見的常染色體顯性遺傳腫瘤綜合征，患病率為1.3.1萬。腫瘤包括甲狀腺腫瘤、胰腺內(nèi)腫瘤和垂體腫瘤，以及其他內(nèi)分腺或神經(jīng)內(nèi)分腺腫瘤和非內(nèi)分腺腫瘤。抑癌基因MEN1突變是本病最主要的原因。MEN1基因位于染色體11q13,全長9kb,包含10個(gè)外顯子,其中2～10號外顯子為編碼區(qū),編碼蛋白含有610個(gè)氨基酸,稱menin。menin主要是一種核蛋白,通過與其他蛋白的相互作用,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等方面發(fā)揮功能。Pannett等提出“二次打擊”模型學(xué)說,即生殖細(xì)胞水平的MEN1雜合突變,為第1次打擊;在體細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)水平,常常發(fā)生某段染色體的缺失,為第2次打擊,最終導(dǎo)致MEN1的發(fā)病。MEN1外顯率較高,有文獻(xiàn)報(bào)道,在MEN1基因突變攜帶者中,20歲時(shí)外顯率達(dá)50%,40歲時(shí)高于95%。故對MEN1患者的家系行MEN1基因檢測有重要的臨床意義。為此,本研究對1例MEN1患者及其家系成員進(jìn)行MEN1基因的篩查,旨在了解MEN1基因突變與患者臨床特征的關(guān)系,并對其家系成員做出早期診斷。1對象和方法1.1影像學(xué)檢查及診斷先證者(Ⅲ:2),男,29歲,因反復(fù)頭暈、乏力5年,加重1個(gè)月于2009年10月收入深圳市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科?；颊?年前無明顯誘因反復(fù)出現(xiàn)頭暈、乏力、饑餓感(因易饑,進(jìn)食5～7餐·d-1,體質(zhì)量增加),伴出汗,嚴(yán)重時(shí)有意識模糊,進(jìn)食后癥狀可緩解。入院前1個(gè)月上述癥狀頻繁發(fā)作,門診檢查:甲狀腺功能正常,血鈣2.94mmol·L-1(正常值為2.05～2.55mmol·L-1),甲狀旁腺素(PTH)190ng·L-1(正常值為15～65ng·L-1),空腹血糖2.07mmol·L-1(正常值為3.9～6.1mmol·L-1)。入院時(shí)體檢:T36.0℃,P80次·min-1,R18次·min-1,BP110/70mmHg(1mmHg=0.133kPa),體質(zhì)量指數(shù)26.45kg·m-2。神清,應(yīng)答如題,雙側(cè)甲狀腺未觸及腫大;雙肺呼吸音清;心率78次·min-1,律齊,各瓣膜聽診區(qū)未聞及病理性雜音;腹平軟,無壓痛、反跳痛;四肢肌力Ⅴ級,雙下肢無浮腫。實(shí)驗(yàn)室檢查:血糖2.32mmol·L-1,同步胰島素27.76kU·L-1(正常值為10～20kU·L-1),血鈣2.65mmol·L-1,同步PTH152.5ng·L-1,血磷1.02mmol·L-1(正常值為0.8～1.5mmol·L-1),尿鈣9.4mmol·24h-1(正常值為2.5～7.5mmol·24h-1)、尿磷16.06mmol·24h-1(正常值為22～48mmol·24h-1)。垂體激素、皮質(zhì)醇分泌節(jié)律及同步促腎上腺皮質(zhì)素(ACTH)均正常,24h尿香草扁桃酸(VMA)正常。雙能X線骨密度測定示骨質(zhì)疏松(T值:股骨頸-3.22,Wards三角-2.74,大轉(zhuǎn)子-1.92,第2腰椎-2.89,第3腰椎-2.66,第4腰椎-2.96)。甲狀腺彩色多普勒超聲示左側(cè)甲狀腺實(shí)質(zhì)性占位性病變。99mTc-甲氧基異丁基異腈(MIBI)雙時(shí)相顯像示甲狀腺左葉下極甲狀旁腺腫大,并功能亢進(jìn)。泌尿系B超示未見結(jié)石征象。腹部CT示胰腺尾部2枚結(jié)節(jié)灶,結(jié)合臨床,擬診斷為胰島素瘤。垂體MRI示垂體左側(cè)見小的、弱強(qiáng)化灶,診斷為微腺瘤?；颊哂?009年10月行胰尾及部分胰體切除術(shù)。術(shù)后,其標(biāo)本送病理科行病理組織學(xué)檢查,報(bào)告示瘤細(xì)胞胞漿豐富,嗜酸性;細(xì)胞核圓形,深染;腫瘤組織間見血管及纖維組織(圖1A-B)。免疫組織化學(xué)檢測示瘤細(xì)胞Insulin(+),Syn(弱+),egA(+),Glucagon(弱+),ACTH(-),PP(-),Calcitoton(-),Castrin(-),Ki-67<1%(+),Somatostatin(-),診斷為胰島素瘤。術(shù)后,曾出現(xiàn)高血糖,經(jīng)胰島素治療,血糖逐漸控制。后停用胰島素,血糖維持在正常水平。復(fù)查血鈣2.81mmol·L-1,同步PTH191.8ng·L-1,血磷0.96mmol·L-1,于2010年5月行左下甲狀旁腺腺瘤+左上甲狀旁腺切除術(shù)。術(shù)后,其標(biāo)本送病理科行病理組織學(xué)檢查,報(bào)告示腫瘤包膜完整;腫瘤細(xì)胞排列成巢狀、條索狀;間質(zhì)血管豐富;瘤細(xì)胞核圓形,深染,未見核分裂;胞漿嗜酸、透明(圖1C-D),病理擬診斷為左甲狀旁腺腺瘤。術(shù)后1周復(fù)查,PTH66.15ng·L-1,血鈣2.14mmol·L-1。結(jié)合病理及臨床,診斷為MEN1。2012年5月,隨訪患者健康,無不適?？崭寡?.2mmol·L-1,空腹胰島素12.76kU·L-1,血鈣2.26mmol·L-1,PTH45.5ng·L-1。先證者的爺爺有類似疾病史,已過世,可疑死于嚴(yán)重低血糖。先證者的父親(59歲),因反復(fù)腰痛及肉眼血尿于2001年5月在汕頭市某醫(yī)院門診就診,診斷為泌尿系多發(fā)結(jié)石、甲狀旁腺腺瘤,并于2001年5月行甲狀旁腺瘤切除術(shù),其于2009年10月在深圳市人民醫(yī)院門診就診,實(shí)驗(yàn)室檢查:血鈣輕度升高(2.56mmol·L-1),血PTH輕度升高(75.72ng·L-1),空腹血糖、空腹胰島素均正常;B超示雙腎、輸尿管、膀胱多發(fā)結(jié)石。先證者的大伯(父親的哥哥,67歲)、大哥(31歲)、妹妹(27歲)及先證者的2個(gè)女兒(分別為4、9歲)、先證者大哥的兒子(侄子,3個(gè)月)均無特殊疾病史。先證者的大哥于2009年10月在深圳市人民醫(yī)院門診就診,實(shí)驗(yàn)室檢查:PTH輕度升高(87.51ng·L-1),血鈣、血磷、空腹血糖、空腹胰島素均正常。先證者的大伯、妹妹、2個(gè)女兒及侄子于2009年10月在深圳市人民醫(yī)院門診就診,實(shí)驗(yàn)室檢查:血鈣、血磷、PTH、空腹血糖、空腹胰島素均在正常范圍內(nèi)。1.2pcr擴(kuò)增及純化1)抽取先證者(MEN1患者)及其大伯、父親、大哥、妹妹、侄子、大女兒、小女兒的外周抗凝血5mL。2)采用標(biāo)準(zhǔn)的酚/氯仿抽提法提取人血白細(xì)胞基因組DNA(美國Sigma公司)。使用PrimerExpress2.0軟件(美國ABI公司)設(shè)計(jì)MEN1基因9個(gè)外顯子的引物(表1),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3)取20μLPCR反應(yīng)體系[基因組DNA100ng·L-1、引物0.5μL(10mmol)、10×PCRbuffer2μL、dNTP0.5μL(10mmol)、TaqDNA聚合酶0.5μL],PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,60℃退火35s,72℃延伸60s,共35個(gè)循環(huán)。最后,72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)由1.2%的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色,在紫外凝膠成像系統(tǒng)(天能公司)中觀察DNA條帶。DNA測序:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL加入蝦堿酶(美國USB公司)2μL進(jìn)行純化,擴(kuò)增條件:37℃60min,80℃15min。得到產(chǎn)物送華大公司進(jìn)行測序,測到突變位點(diǎn)至少重復(fù)驗(yàn)證1次。2第一、對第三大建模單位ma1基因檢測先證者(MEN1患者)及其父親、大哥均為MEN1患者,大女兒、侄子均為MEN1基因突變攜帶者,大伯、妹妹及小女兒MEN1基因檢測未見異常。見圖2?；蛐蛄袦y序結(jié)果顯示,正常人的終止密碼子為TGC(圖3A),而MEN1患者位于第10號外顯子上第1227位的核苷酸發(fā)生了C>A的雜合突變,終止密碼子TGA提前出現(xiàn),menin蛋白截短,MEN1基因突變(圖3B)。3突變與細(xì)胞基因突變MEN1是一種家族遺傳性腫瘤綜合征,呈常染色體顯性遺傳,具有外顯率高和臨床表現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。2001年的《多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤1型及2型的診斷與治療指南》中提出:MEN1的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為擁有3個(gè)最常見的內(nèi)分泌腫瘤(即甲狀旁腺腫瘤、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、垂體腺瘤)中的2個(gè)即可診斷為MEN1。除滿足這條以外,一級親屬中至少1人患有1個(gè)上述腫瘤就可診斷為家族性MEN1。自1997年MEN1基因被確定以來,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),MEN1基因的突變位點(diǎn)分散在menin的開放閱讀框及其附近區(qū)域,9個(gè)編碼的外顯子都可出現(xiàn)。突變類型多種多樣,且沒有明確的熱點(diǎn)。至今共發(fā)現(xiàn)了約565種不同的MEN1基因突變,包括459種胚系突變和203種體細(xì)胞突變,其中61種突變既存在于胚系突變中,又存在于體細(xì)胞突變中,絕大多數(shù)突變都會造成編碼蛋白質(zhì)menin的缺如或截短。有研究表明,在menin蛋白的C末端至少包含有3個(gè)核定位信號(NLSs),在menin蛋白的細(xì)胞核定位中發(fā)揮重要的作用。另外,突變體蛋白缺失NLSs,使得蛋白亞細(xì)胞定位異常,最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。在臨床工作中,發(fā)生MEN1各內(nèi)分泌腫瘤是一個(gè)逐漸的過程。在尚未完全外顯時(shí),則僅表現(xiàn)為單一腫瘤。因此,很難區(qū)分某一單一內(nèi)分泌腫瘤是MEN1的早期表現(xiàn),還是單純內(nèi)分泌腫瘤。Lemos等發(fā)現(xiàn),58%的MEN1基因突變攜帶者有臨床癥狀;13%的MEN1基因突變攜帶者僅有生化檢查異常,而沒有臨床癥狀;剩余29%的MEN1基因突變攜帶者既沒有臨床癥狀,也沒有生化的異常,此時(shí),行MEN1基因篩查則可明確診斷。Brandi等在MEN1的診療指南中指出,對于MEN1的先證者及其未受累的親屬,都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行MEN1基因的篩查;對于基因篩查發(fā)現(xiàn)的MEN1突變基因攜帶者,應(yīng)當(dāng)定期進(jìn)行生化和影像檢查,篩查腫瘤的發(fā)生。本研究根據(jù)生化檢查和MEN1基因序列檢測結(jié)果顯示,先證者的父親、大哥均為MEN1患者,需進(jìn)一步檢查、治療。先證者的侄子和大女兒,年齡分別為3個(gè)月及9歲。雖目前健康,均無臨床癥狀及生化指標(biāo)的異常,但為MEN1突變基因攜帶者,均需定期檢查、終生隨訪。MEN1具有臨床表現(xiàn)多樣化的特點(diǎn),目前的研究并未發(fā)現(xiàn)基因突變類型與臨床表型之間存在明確的對應(yīng)關(guān)系,相同基因突變類型在不同家系及同一家系的不