臨床分離耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究

臨床分離耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究

銅綠假單胞菌（pae）是一種廣泛分布于自然界和健康人的皮膚、腸道和呼吸道。在正常情況下，它不會(huì)感染人體的任何組織。然而，如果身體的免疫水平降低，嚴(yán)重傷口和醫(yī)療操作后，它可能會(huì)感染大多數(shù)人體的組織。臨床可表現(xiàn)為局部化膿性炎癥和全身性感染,常常危及患者的生命。亞胺培南(IMP)為碳青酶烯類藥物,是一種新型的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,其抗菌譜廣,對(duì)革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性菌、需氧菌、厭氧菌皆有很強(qiáng)的抗菌活性。藥物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),亞胺培南對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定(含ESBLs、AmpC酶),與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)親和力強(qiáng),并能夠有效滲透細(xì)菌外膜進(jìn)入周質(zhì)間隙,具殺菌活性強(qiáng)大等特點(diǎn),被認(rèn)為是目前控制臨床感染性疾病最為有效的藥物之一,但隨著廣泛使用和過度使用,其耐藥性也逐漸增加。因此,我們分析了我院34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌(IMPRPAE)對(duì)常用抗菌藥物的耐藥特點(diǎn),并從碳青酶烯酶、金屬酶產(chǎn)生,膜微孔蛋白丟失以及細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)外排泵表型特征3個(gè)方面,對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了研究,現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。1菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)方法1.1菌株來源與質(zhì)控菌株34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌來自于2005年1-12月我院住院患者臨床分離的標(biāo)本(包括痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等)。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922。1.2主要儀器設(shè)備與試劑Eppendorfcentrifuge5417R低溫離心機(jī),恒溫金屬浴(杭州大和),MJPeltierThermalCycler(MJResearch),Bio-Rad電泳儀,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng),瓊脂糖(英國(guó)Oxoid公司),100bpDNA梯帶標(biāo)志物(大連寶生物),6×加樣(loading)緩沖液(北京天為時(shí)代),氰氯苯腙(CCCP)終濃度5mg/L(Sigma),IMPEtest試條(0.002~32μg/ml)(瑞典ABBiodisk)M-H培養(yǎng)基(杭州天和),頭孢哌酮/舒巴坦藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)。1.3菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)方法所有菌株均以BDPhoenix100全自動(dòng)微生物分析儀鑒定到種,必要時(shí)采用ATB或傳統(tǒng)生化方法補(bǔ)充鑒定。藥敏試驗(yàn)采用BDPhoeni×100配套藥敏試驗(yàn)復(fù)合板,包括阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、四環(huán)素、復(fù)方新諾明共16種抗菌藥物,頭孢哌酮/舒巴坦采用K-B法。模板DNA提取,采用蛋白酶K消化法。1.4基因擴(kuò)增oprD2基因熱循環(huán)參數(shù)為93℃預(yù)變性3min→93℃30s→55℃30s→72℃60s,最后一個(gè)72℃延伸5min,共循環(huán)35周期。其余基因熱循環(huán)參數(shù)為:93℃預(yù)變性3min→93℃60s→55℃60s→72℃60s,最后一個(gè)72℃延伸5min,共循環(huán)35周期。純水為陰性對(duì)照。耐藥基因檢測(cè)試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。應(yīng)用PCR方法,引物序列見表1。1.5結(jié)果判斷取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物與2μl6×上樣緩沖液混勻,點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠,在100V電壓電泳30min,出現(xiàn)目的條帶即為檢測(cè)基因陽(yáng)性,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。1.6CCCP對(duì)主動(dòng)外排泵表型特征的影響配制水解酪蛋白(M-H)瓊脂和含CCCP(終濃度5mg/L,該濃度對(duì)外排泵有較好抑制作用,而對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無影響)的M-H瓊脂平皿,挑取2~3個(gè)過夜培養(yǎng)的菌落,用生理鹽水調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?按照K-B法標(biāo)準(zhǔn)操作程序涂布菌懸液和貼Etest試條,放35℃培養(yǎng)24h,觀察CCCP對(duì)IMP的MIC的逆轉(zhuǎn)作用。當(dāng)存在CCCP時(shí)IMP的MIC比缺乏時(shí)相應(yīng)的MIC下降至原值的1/4,提示主動(dòng)外排機(jī)制存在。2ccp存在對(duì)imp體外抗菌活性的影響2.1耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥特點(diǎn)IMPRPAE除對(duì)阿米卡星100%敏感、對(duì)哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦較敏感,敏感率48%~55%;對(duì)其余β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素、磺胺類抗菌藥物耐藥嚴(yán)重,結(jié)果見表2。2.2耐藥基因檢測(cè)結(jié)果34株IMPRPAE中,檢測(cè)到IMP陽(yáng)性6株,陽(yáng)性率17.6%,oprD2基因缺失1株,陽(yáng)性率2.9%,其余耐藥基因(VIM、GIM、SPM、OXA-10、GES)未檢出。耐藥基因電泳結(jié)果見圖1、2。2.3CCCP存在與否對(duì)IMP體外抗菌活性的影響34株IMPRPAE中,CCCP存在使IMPMIC下降至4個(gè)濃度梯度的菌株有4株,占11.8%;下降至3個(gè)濃度梯度的菌株有4株,占11.8%;下降至2個(gè)濃度梯度的菌株有5株,占14.7%;其余的菌株在CCCP存在與否IMP的MIC值無變化,占61.7%。提示IMPRPAE對(duì)IMP主動(dòng)外排的耐藥機(jī)制占11.8%。3碳青酶烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制近10多年來,由于廣譜頭孢菌素及碳青酶烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌耐藥率有增長(zhǎng)趨勢(shì),特別是多重耐藥和IMPRPAE是臨床抗感染治療的難點(diǎn)之一,倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。我院2005年1-12月分離的34株IMPRPAE除對(duì)阿米卡星敏感(敏感率100%)外,哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦對(duì)PAE有較強(qiáng)的抗菌活性,敏感率48%~54%;三代、四代頭孢菌素、氨曲南、喹諾酮類等抗菌藥物抗菌活性差,敏感率為3%~29%。對(duì)美羅培南敏感的有29%,提示PAE對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥機(jī)理不盡相同。34株IMPRPAE對(duì)氯霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素全部耐藥。因此,應(yīng)重視和加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè),合理應(yīng)用和優(yōu)先選用低耐藥可能性的抗菌藥物,將有助于控制細(xì)菌耐藥,避免IMPRPAE引起醫(yī)院感染流行。銅綠假單胞菌因其固有和獲得性耐藥,對(duì)IMP的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜,通常包括產(chǎn)酶、膜孔蛋白丟失、泵出機(jī)制、生物膜形成、青霉素結(jié)合蛋白改變等多種機(jī)制。碳青酶烯酶是能夠明顯水解碳青酶烯類抗菌藥物的一類β-內(nèi)酰胺酶,它包括Ambler分子分類為A、B、D類3類酶,其中B類為金屬酶,屬Bush分類中的3組,是PAE耐碳青酶烯類抗菌藥物的主要β-內(nèi)酰胺酶,可由染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)。目前發(fā)現(xiàn)的獲得性金屬酶包括IMP、VIM、GIM、SPM4種,以IMP和VIM常見。D類β-內(nèi)酰胺酶即OXA酶(OXA-23~-27)常見于不動(dòng)桿菌屬,國(guó)外已在PAE中發(fā)現(xiàn)多種OXA型酶基因,國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少,蔣曉飛等曾報(bào)道在8株多重耐藥PAE中檢出blaoxa-10型基因(同時(shí)還存在blaveb-1基因),諸葛青云等從28株IMPRPAE中檢出1株blaoxa-10型基因。A類酶是青霉素酶,對(duì)亞胺培南的水解活性強(qiáng)于美羅培南,可引起青霉素類、氨曲南和碳青酶烯類耐藥,第三代頭孢菌素敏感,他唑巴坦、克拉維酸可以抑制此類酶,主要見于一些腸桿菌科細(xì)菌以及肺炎克雷伯菌,銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的GES-2是2000年首次在南非發(fā)現(xiàn),南非在一次由產(chǎn)GES-2型酶的銅綠假單胞菌引起的暴發(fā)流行死亡率達(dá)62.5%。本研究中IMP陽(yáng)性菌株占17.6%,未檢測(cè)到其他金屬酶和碳青酶烯酶,提示產(chǎn)IMP型金屬酶是PAE對(duì)IMP耐藥的機(jī)制之一。oprD分為D1和D2,研究發(fā)現(xiàn)與亞胺培南耐藥有關(guān)的為外膜孔蛋白(OprD2),銅綠假單胞菌外膜蛋白孔道是小分子的亞胺培南選擇性快速進(jìn)入菌體的特異性通道,也允許帶有陽(yáng)性電子基團(tuán)的各種糖類及堿性氨基酸非特異擴(kuò)散。OprD2蛋白是目前所知的PAE外膜中惟一有助于抗菌藥物通透的孔道蛋白,具有配體特異性,不僅能形成亞胺培南的特異結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸為亞胺培南的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均不能通過OprD2通道,所以碳青酶烯類抗菌藥物與其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物無交叉耐藥性。一般認(rèn)為OprD2缺失是PAE對(duì)IMP耐藥的主要機(jī)制,但本研究oprD2基因缺失占2.9%,與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道差別較大,提示oprD2基因缺失不是本組IMPRPAE耐藥的主要原因,但不排除因oprD2基因突變或基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致PAE對(duì)IMP耐藥,后續(xù)研究正在進(jìn)行中。PAE細(xì)胞膜上的主動(dòng)外排蛋白是導(dǎo)致PAE對(duì)多種抗菌藥物表現(xiàn)固有或獲得性多重耐藥的原因,這些蛋白包括控制抗菌藥物進(jìn)出細(xì)胞的外膜通道蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)抗菌藥物的內(nèi)膜蛋白和膜連接蛋白。PAE細(xì)胞膜上的這些主動(dòng)外排蛋白組成了主動(dòng)外排系統(tǒng),主要有MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM4種,其中MexAB-OprM最為重要。OprM表達(dá)過度可導(dǎo)致對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青酶烯類、喹諾酮類、氯霉素、磺胺類藥物耐藥。CCCP為質(zhì)子泵抑制劑的代表制劑,能破壞細(xì)菌跨胞漿膜的質(zhì)子梯度,導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失去能量供應(yīng)而起作用。一般認(rèn)為CCCP作用使IMPRPA