益生乳桿菌質(zhì)粒形成的耐藥性及耐藥基因分析

益生乳桿菌質(zhì)粒形成的耐藥性及耐藥基因分析

廣泛應(yīng)用于食品、藥物、乳液、飼料等行業(yè)，并與人們的日常生活密切相關(guān)。FAO/WHO在《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導(dǎo)原則》中指出,未經(jīng)評估的益生菌可能會存在一些潛在的安全性問題,其中,長期使用的益生菌所攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)移是人們所擔(dān)憂的。目前,抗生素濫用已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會問題,由此引發(fā)的細(xì)菌耐藥性問題也日趨嚴(yán)峻。盡管傳統(tǒng)的益生菌菌種已有很長的安全使用歷史,如德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgricus),然而伴隨著新菌種的不斷開發(fā)和進(jìn)入市場,其潛在的安全性問題也逐漸引起人們的重視。近十年來,有關(guān)乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的耐藥性方面已經(jīng)開展了一定的研究工作。研究發(fā)現(xiàn),大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌的抗菌藥具有耐藥性,例如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素,其中部分乳桿菌對萬古霉素、卡那霉素、多黏菌素B等表現(xiàn)出抗藥性。D’aimmo等報(bào)道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關(guān)的基因,如長雙歧(Bifidobacteriumlongum)抗四環(huán)素的基因tet(W),干酪乳桿菌(L.casei)抗四環(huán)素和紅霉素的質(zhì)?；騮et(M)和erm(B)等。Toomey等和ANA等則進(jìn)一步報(bào)道了抗四環(huán)素基因tet(M)在菌株間的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。顯然,這種抗藥基因在菌種間的轉(zhuǎn)移會對人類的健康產(chǎn)生影響。食品是益生菌的主要載體,益生菌的安全性勢必影響到其食品的安全,因此其耐藥性以及抗生素抗性是否可轉(zhuǎn)移就會引起人們的重視。本研究對前期篩選到的幾株能夠耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶的乳桿菌的耐藥性進(jìn)行了研究,通過質(zhì)粒消除探討了耐藥性與質(zhì)粒的相關(guān)性,對進(jìn)一步確定耐藥性的轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ),旨在為潛在益生乳桿菌的安全性評價(jià)及其評價(jià)方法的建立提供理論和技術(shù)參考。1材料和方法1.1質(zhì)粒、試劑與儀器5株耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶且含有質(zhì)粒的乳桿菌其菌種編號、名稱及來源見表1,該菌種均由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)收藏;抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株采用CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所,簡稱CLSI,以前稱NCCLS)推薦的大腸桿菌ATCC25922,購自中國科學(xué)院微生物研究所;乳桿菌采用MRS培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng);大腸桿菌ATCC25922采用LB培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng);氨芐西林10μg/片、桿菌肽0.04U/片、青霉素G10U/片、多粘菌素B300μg/片、利福平5μg/片、頭孢噻吩30μg/片、鏈霉素10μg/片、卡那霉素30μg/片、四環(huán)素30μg/片、氯霉素30μg/片、慶大霉素10μg/片、萘啶酸30μg/片、萬古霉素30μg/片(直徑6mm)均購自中國藥品生物制品檢定所,符合CLSI標(biāo)準(zhǔn);SDS、EB、氯霉素、氨芐青霉素美國Sigma公司;質(zhì)粒提取試劑盒、PCRMix、100bpLadderMarker北京天根試劑公司;λHindⅢMarker、HB101上海寶生物公司;溶菌酶Biotech公司。GL-20G-II型冷凍離心機(jī)、TGL-16G型臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;XSZ-G型光電顯微鏡重慶光學(xué)儀器廠;SPX-150B型生化培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;BTS-20M型凝膠成像系統(tǒng)、TGradientThermocycler96型PCR儀德國Biometra公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1抗菌藥物敏感性檢測參考管遠(yuǎn)志等的方法。待測菌在MRS培養(yǎng)基(蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,酵母膏5.0g/L,檸檬酸氫二銨2.0g/L,葡萄糖20.0g/L,吐溫801.0mL/L,乙酸鈉5.0g/L,磷酸氫二鉀2.0g/L,硫酸鎂0.58g/L,硫酸錳0.25g/L,pH6.2±0.2)中,37℃培養(yǎng)16h后,以無菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度(菌體濃度約為5×108CFU/mL)。取該菌液1mL入滅菌平皿中,將融化的MH固體培養(yǎng)基(牛肉膏6.25g/L;酪蛋白胨17.5g/L;可溶性淀粉1.5g/L;瓊脂1.3%;pH7.2±0.2,)約20mL倒入平皿,混勻。待培養(yǎng)基凝固后,室溫放置3~5min,用鑷子將藥敏紙片貼放在平皿上,輕壓使緊貼瓊脂表面,靜置5min,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi),恒溫培養(yǎng)16~18h。量取抑菌圈直徑,并記錄結(jié)果。以標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌,操作同上。受試菌株對多種抗生素的敏感性參照國際現(xiàn)行的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》第十九版信息增刊提供的紙片法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定(見表2)。報(bào)告該受試菌對該抗生素是敏感(susceptible,S)、耐藥(resistant,R)、還是中介(intermediate,I)。1.2.2溶菌酶trshcl法取培養(yǎng)過夜的菌液10mL于離心管中,10000r/min離心5min,棄去上清,向沉淀中加入10mg/mL溶菌酶(以pH8.0,10mmol/L的TrisHCl配制)500μL,搖勻,37℃水浴45min。采用質(zhì)粒提取試劑盒,對待測菌株質(zhì)粒進(jìn)行提取,并進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,以λHindⅢ為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。1.2.3絕粒精華1.2.3.1.sds法1.2.3.質(zhì)粒提取與用藥實(shí)驗(yàn)將待測菌株以2%的接種量接至含有不同濃度SDS的滅菌MRS培養(yǎng)基中(SDS濃度分別為0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%),37℃恒溫培養(yǎng)24h,再以2%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌MRS培養(yǎng)基中,42℃恒溫培養(yǎng)24h,此為一個(gè)循環(huán),重復(fù)2~3次,以質(zhì)粒消除前菌株為對照,分別進(jìn)行質(zhì)粒提取,并對消除后的菌株進(jìn)行抗生素敏感性檢測。1.2.4菌株全序列的合成在NCBI中查到質(zhì)粒上的β-內(nèi)酰胺類抗性基因blr、ECP-1569、nps-1,以及氯霉素抗性基因cmlA、cat、cmlA1,在Genbank中下載其全序列,設(shè)計(jì)引物,序列見表3,委托三博遠(yuǎn)志公司合成。以待測菌株的質(zhì)粒DNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,相應(yīng)溫度退火30s,72℃延伸1min,34次循環(huán),72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳(80~120V,30min),觀察產(chǎn)物電泳帶及其位置,按照100bpLadderMarker確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。委托寶生物工程(大連)有限公司對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、測序。2結(jié)果與分析2.1抗菌藥物敏感性檢測采用K-B藥敏紙片法檢測5株乳桿菌對13種抗生素的敏感性,記錄抗生素對供試菌株的抑菌圈直徑,結(jié)果見表4。按照CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》提供的紙片法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定,結(jié)果如表5所示。據(jù)表5可知,待測的5株乳桿菌對萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸具有普遍的抗性,耐藥率達(dá)100%,而主要對四環(huán)素敏感,其中,嗜酸乳桿菌LL對11種抗生素(除青霉素G、利福平外)表現(xiàn)出較普遍的抗性。2.2菌種質(zhì)粒dna條帶和耐藥基因檢測采用質(zhì)粒提取試劑盒對待測乳桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行提取,結(jié)果如圖1所示。注:1.CH8;2.LL;3.Lp-A;4.L11;5.LLB;M:λHindⅢMarker。由圖1可見,戊糖乳桿菌CH8的電泳圖顯示有6條質(zhì)粒DNA條帶,其中一條大于23kb。戊糖乳桿菌Lp-A顯示有兩條質(zhì)粒DNA條帶,分別為10kb、5kb左右。嗜酸乳桿菌LL和植物乳桿菌L11分別顯示有2條和4條質(zhì)粒DNA條帶,均含有一條10kb左右的質(zhì)粒條帶。瑞士乳桿菌LLB的電泳圖僅顯示一條10kb左右的質(zhì)粒DNA條帶。乳酸菌中普遍存在著質(zhì)粒,至少25種乳桿菌具有固有質(zhì)粒,而且一種菌有多個(gè)質(zhì)粒,質(zhì)粒大小一般在1.9~84.8kb,絕大多數(shù)的質(zhì)粒小于20kb。Gevers等(2003)對風(fēng)干香腸中的乳桿菌進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)這些乳桿菌均具有10kb左右的質(zhì)粒,且在這些質(zhì)粒上攜帶了四環(huán)素耐藥基因tetM。在細(xì)菌的傳代過程中,某些質(zhì)粒可能會從細(xì)胞中消失,但大多數(shù)的質(zhì)粒是穩(wěn)定存在的。本研究也對傳代30代后上述乳桿菌菌株的質(zhì)粒進(jìn)行了檢測,結(jié)果證明了其質(zhì)粒的穩(wěn)定性。2.3質(zhì)粒消除方法耐藥質(zhì)粒的存在是細(xì)菌耐藥性的一個(gè)主要原因,因此質(zhì)粒消除是耐藥性消除的一種重要方法。質(zhì)粒消除便于觀察比較消除前后菌體表型的變化,從而得出質(zhì)粒的遺傳功能,在對于質(zhì)粒所含基因的研究中具有重要意義。2.3.1sds法以去除沉積物2.3.1.sds濃度對植物乳桿菌質(zhì)粒的影響采用濃度為0.05%~0.25%的SDS分別處理供試菌株,在SDS濃度為0.15%、0.2%和0.25%時(shí),上述菌株均不能存活;濃度為0.1%時(shí)戊糖乳桿菌Lp-A和植物乳桿菌L11不能存活。因此選擇SDS處理后存活的菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測,結(jié)果如圖2~圖6所示。結(jié)果表明,SDS濃度為0.05%時(shí),植物乳桿菌L11的四條質(zhì)粒(在1~10kb不等)被完全消除(見圖4,泳道2),戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒沒有被消除。當(dāng)SDS濃度增加到0.1%時(shí),戊糖乳桿菌CH8的6條質(zhì)粒丟失了5條,包括一條大于23kb的質(zhì)粒及2kb到10kb間大小不等的4條質(zhì)粒,一條15kb左右的質(zhì)粒沒有被消除(見圖2,泳道3)。而嗜酸乳桿菌LL(見圖3)、戊糖乳桿菌Lp-A(見圖6)和瑞士乳桿菌LLB(見圖5)的質(zhì)粒均未被消除。由此可見,用SDS消除乳桿菌質(zhì)粒的效果不顯著,與之前的相關(guān)報(bào)道不相符。2.3.1.質(zhì)粒消除前后ch8菌株的抗菌藥活性檢測采用K-B藥敏紙片法檢測質(zhì)粒消除后的CH8和L11菌株對抗生素的敏感性,結(jié)果見表6。由表6可知,戊糖乳桿菌CH8質(zhì)粒消除前后,其抗生素敏感性發(fā)生了部分變化。質(zhì)粒消除前,CH8菌株對氯霉素和頭孢噻吩均表現(xiàn)出抗性,而消除后對這兩種抗生素均表現(xiàn)出敏感,對其他11種抗生素的敏感性沒有變化。可見,消除的質(zhì)粒上可能含有抗氯霉素和頭孢噻吩的抗性基因。而植物乳桿菌L11消除了全部質(zhì)粒后,與消除前相比,其抗生素敏感性沒有變化,這也初步表明,植物乳桿菌L11的質(zhì)粒上不含有所試抗生素的抗性基因,或者在質(zhì)粒和基因組上同時(shí)含有所試抗生素的抗性基因。2.3.2sds-高溫法可以去除沉積物2.3.2.sds-高溫對ch8部分菌株質(zhì)粒的影響采用濃度0.01%~0.03%的SDS分別處理供試菌株,并進(jìn)行高溫培養(yǎng)。在SDS濃度為0.01%、0.015%和0.02%時(shí),上述乳桿菌均存活,但只有CH8的質(zhì)粒被部分消除,且消除效果并不隨濃度的增加而改變,濃度為0.025%、0.03%時(shí),CH8和部分菌株不能存活,仍具有存活能力的菌株,其消除效果不隨SDS濃度的增加而改善。因此選擇SDS-高溫處理后存活菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測,結(jié)果如圖7~圖11所示。結(jié)果表明,嗜酸乳桿菌LL(見圖8)、戊糖乳桿菌Lp-A(見圖9)、瑞士乳桿菌LLB(見圖10)和植物乳桿菌L11(見圖11)在SDS-高溫處理后質(zhì)粒并沒有被消除,而戊糖乳桿菌CH8的6條質(zhì)粒中丟失了5條(見圖7,泳道1、2、3),被部分消除。注:M:Marker,1:對照,2:0.01%SDS,3:0.015%SDS,4:0.02%SDS。2.3.2.2.去除顆粒后對植物和抗生素的敏感性改變2.4戊糖乳桿菌的質(zhì)粒與菌株的基因型定位以戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒為模板,以表3中相應(yīng)的序列為引物,進(jìn)行PCR反應(yīng),結(jié)果如圖12所示。由圖12可見,戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒上存在β-內(nèi)酰胺類抗性基因blr,不含有其他抗性基因。對上述目的條帶進(jìn)行回收、測序,并經(jīng)DNAmanaligment分析發(fā)現(xiàn),該序列與目的序列僅在第43和64位點(diǎn)有兩個(gè)堿基的差異,很可能是由于菌株差異造成的。因此可以初步確定戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒上含有blr基因,且該基因是決定其頭孢噻吩抗性的基因。將該戊糖乳桿菌CH8菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。然而,要確定blr基因位于CH8菌株的哪些質(zhì)粒上還有待于進(jìn)一步研究。國內(nèi)外常用的藥敏檢測方法都是通過細(xì)菌的表型來判斷其耐藥性,且對于抗性基因的研究多集中于致病菌。如果能在菌株抗生素抗性的表型與基因型之間建立聯(lián)系,就可能對該表型對應(yīng)的基因進(jìn)行定位,從而從分子水平對細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行深入分析。目前,我國還少見由益生菌感染動(dòng)物及人體的報(bào)道,也缺乏對其耐藥性及使用后的流行病學(xué)調(diào)查資料,對益生菌的安全性評價(jià)手段與國際水平還處在一定的差距。隨著越來越多的新菌種申報(bào)進(jìn)入國內(nèi)市場以,也附帶了不安全性的風(fēng)險(xiǎn)。因此,本研究方法可以為乳制品市場常用益生菌菌種的安全性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估,為建立適合國情的益生菌安全性評價(jià)體系提供技術(shù)依據(jù)。3質(zhì)粒消除前后戊糖乳桿菌的耐藥性分析3.1以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株,對5株潛在益生乳桿菌的抗生素敏感性研究表明,菌株均對萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸表現(xiàn)出普遍的抗性,耐藥率達(dá)100%。3.2無論采用SDS還是SDS-高溫法消除質(zhì)粒方法,僅對部分菌株中的某些質(zhì)粒有效,即不同菌株之間,對于不同的質(zhì)粒其消除方法的有效性存在著差異。3.3對消除質(zhì)粒后的戊糖乳桿菌CH8抗生素敏感性的分析表明,CH8菌株的質(zhì)粒上存在決定其頭孢噻吩抗性的基因blr,這在一定程度上反映出益生乳桿菌質(zhì)?？股乜剐曰蚺c其耐藥性間存在相關(guān)性。將待測菌株以2%的