基因工程：DNA重組技術(shù)的基本工具

生物技術(shù)基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程1、DNA是遺傳物質(zhì)的證明2、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3、遺傳密碼的破譯4、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)5、工具酶的發(fā)明6、DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明7、DNA體外重組的實現(xiàn)8、重組DNA表達(dá)實驗的成功9、第一例轉(zhuǎn)基因動物問世10、PCR技術(shù)的發(fā)明生物科學(xué)蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白棉花細(xì)胞殺死害蟲抗蟲棉的培育一、DNA重組技術(shù)1、DNA重組技術(shù)的概念：又叫做基因工程或基因拼接技術(shù)。通俗地說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。對象：環(huán)境：過程：水平：結(jié)果：生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)定向改造生物的性狀或獲得人們所需要的基因產(chǎn)物2、DNA重組技術(shù)的原理：DNA重組技術(shù)是把一種生物的某種基因作為整體轉(zhuǎn)移到另一種生物體的細(xì)胞內(nèi)，基因仍然具有一定的獨(dú)立性和完整性；基因的結(jié)構(gòu)基本沒有變化，只是位置發(fā)生了改變，所以屬于基因重組。3、DNA重組技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：可以實現(xiàn)基因在不同種生物之間的轉(zhuǎn)換，可以打破有性生殖的遠(yuǎn)緣雜交不親和的生殖障礙，迅速培育出前所未有的新品種。二、DNA重組技術(shù)的基本工具1、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

2、DNA連接酶——“分子縫合針”

3、進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”

（準(zhǔn)確切割DNA的工具。）（DNA片段的連接工具。）（轉(zhuǎn)移基因的工具。）1、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

①存在：主要從原核生物中分離純化出來的。③特點(diǎn)：一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。④實例：EcoRⅠ限制酶能專一識別GAATTC序列，并在G和A之間切割。SmaⅠ限制酶能專一識別CCCGGG序列，并在C和G之間切割。⑤切割結(jié)果：一般產(chǎn)生2個帶有黏性末端或者是平末端的DNA片段。②作用：基因工程中重要的切割工具，能將外來的DNA切斷，對自己的DNA無損害。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是一種防御工具，當(dāng)外源DNA侵入時，原核生物會利用限制酶將外源DNA切割掉，使之不能表達(dá)而失效，保證自身的安全。這是生物長期進(jìn)化的過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，可以將外源入侵的DNA降解掉。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷。限制酶在原核生物中的作用是什么？為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？思考與討論：1、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”特點(diǎn)：一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。EcoRⅠ限制酶EEscherichia大腸桿菌（屬）cocoli大腸桿菌（種）RRY13R菌株（品系）Ⅰ首先發(fā)現(xiàn)在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序從大腸桿菌R菌株中分離出的第一種限制酶EcoRⅠ限制酶能夠?qū)Ｒ蛔R別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。黏性末端（可互補(bǔ)配對）思考：限制性內(nèi)切酶切割的是什么？限制酶切割的是：在DNA分子骨架上，兩個相鄰的脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。AAGTTTTCCGAA限制酶切割DNA分子之后形成了什么？EcoRⅠ（在G與A之間切割）SmaⅠ（在G與C之間切割）黏性末端（在中軸線兩側(cè)切割DNA）平末端（在中軸線處切割DNA）中軸線思考：如果把兩種生物的DNA用同一種限制酶來切割，會怎么樣呢？會產(chǎn)生相同（互補(bǔ)）的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組DNA分子了。G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G雙鏈斷開雙鏈斷開不同來源的DNA片段結(jié)合2、DNA連接酶——“分子縫合針”

思考：DNA連接酶連接的是什么？將雙鏈DNA分子片段“縫合”起來，恢復(fù)兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。形成新的磷酸二酯鍵AAAAGGTTTTCC①作用對象：兩個具有相同黏性末端的DNA片段。②作用位置：脫氧核糖與磷酸之間的缺口。③作用結(jié)果：連接磷酸和脫氧核糖形成磷酸二酯鍵，即形成重組DNA。DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵1、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源連接末端類型共性T4噬菌體大腸桿菌只能連接黏性末端既可連接黏性末端，又可連接平末端。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。2、根據(jù)酶的來源不同，可以分為兩大類：注*：T4DNA連接酶連接平末端的效率比較低。3、進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”

①作用：②特點(diǎn)：（運(yùn)載體必須具備的條件）a、將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。b、利用它在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行自我復(fù)制。a、能在受體細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并穩(wěn)定保存，并且對受體細(xì)胞無害。b、具有多種限制酶單一切點(diǎn)，便于與多種外源基因連接。c、具有某些標(biāo)記基因，便于目的基因的檢測。③常用運(yùn)載體——質(zhì)粒：存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物的細(xì)胞中，是擬核或細(xì)胞核外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。也可以用噬菌體（細(xì)菌病毒）或動植物病毒。b.限制酶切割位點(diǎn)c.標(biāo)記基因a.能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制。質(zhì)粒病毒（噬菌體和動植物病毒）在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。1、限制性內(nèi)切酶；2、DNA連接酶；3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。總結(jié)1、總結(jié)本節(jié)課的主要內(nèi)容；2、完成P**的課后練習(xí)題；3、完成本節(jié)課的**和**；4、預(yù)習(xí)第一章第二節(jié)《基因工程的基本操作程序》。課下作業(yè)本章總概念圖本節(jié)概念圖科技探索之路20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破1、1944年，艾弗里（O.Avery）等人通過不同類型肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗，不僅證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體。艾弗里等人的工作可以說是基因工程的先導(dǎo)?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程2、1953年沃森和克里克建立了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，使生物學(xué)進(jìn)入分子水平。1958年梅塞爾松和斯塔爾，以大腸桿菌為實驗材料，運(yùn)用同位素示蹤技術(shù)，用實驗證明了DNA的復(fù)制是以半保留方式進(jìn)行的。1957年克里克提出中心法則的確立。3、1963年，尼倫伯格和馬太做蛋白質(zhì)體外合成實驗，破譯編碼氨基酸的遺傳密碼。技術(shù)發(fā)明命使基因工程的實施成為可能1967年羅思和赫林斯基發(fā)現(xiàn)細(xì)菌質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，為基因轉(zhuǎn)移找到一種運(yùn)載工具。1970年阿爾伯（W.Arber）、內(nèi)森斯（D,Nathans）、史密斯（H.C.Smith）細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制酶。1、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2、工具酶的發(fā)現(xiàn)1972年伯格（P.Berg）首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究，成功地構(gòu)建了第一個人工體外重組DNA分子。4、

DNA體外重組的實現(xiàn)1977年科學(xué)家又發(fā)明了DNA序列分析方法。1965年桑格發(fā)明了氨基酸序列分析技術(shù)。3、DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明1973年，博耶和科恩使重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，并使外源基因可以在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，至此表明基因工程正式問世。1973年，科學(xué)家才將質(zhì)粒作為基因的載體使用。這是基因工程發(fā)展史上第一個成功的基因克隆實驗。1973年，科恩第一個建成“基因工程菌”，并創(chuàng)立基因工程模式。科恩并向美國申報了世界上第一個基因工程的專利技術(shù)?？贫鞅环Q為基因工程發(fā)展史上