DB13-T 5524-2022 抗豆象綠豆品種真實(shí)性和純度鑒定 SSR 分子標(biāo)記法

65.020.01CCS

B

0513 DB

13/T

5524—2022抗豆象綠豆品種真實(shí)性和純度鑒定SSR

分子標(biāo)記法 河北省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB

13/T

5524—2022 本文件按照GB/T

1.1—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1定起草。本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所。劉少興、彭秀國、劉陽。DB

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5524—2022SSR

1范圍本文件規(guī)定了Vigna

radiata

備及試劑、供試樣品、方法步驟和結(jié)果判斷與計(jì)算方法。本文件適用于抗豆象綠豆品種真實(shí)性和純度的檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T

農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T

農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。綠豆象(Callosobruchus

Chinensis)Bruchidae)均有發(fā)生，主要危害綠豆、小豆、豇豆等?？苟瓜缶G豆品種(Bruchids

Resistant

Mungbean

Variety)在人工接種豆象鑒定的條件下，種子被害率小于的綠豆品種。標(biāo)準(zhǔn)樣品

（Standard

）國家指定機(jī)構(gòu)保存的經(jīng)認(rèn)定代表品種特征特性的實(shí)物種子樣品。品種真實(shí)性(Varietal

Genuineness)供檢品種與該品種的標(biāo)準(zhǔn)樣品是否相符。品種純度(Varietal

品種在特征特性方面典型一致的程度，用與供檢品種標(biāo)準(zhǔn)特征特性表現(xiàn)一致的本品種的種子數(shù)占樣品種子總數(shù)的百分率表示。SSR

分子標(biāo)記（Simple

Sequence

Repeats

Marker）也稱為微衛(wèi)星

DNA)標(biāo)記，是基于單個微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單元在數(shù)量上的變異而發(fā)展起來一種分子標(biāo)記。微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目在不同材料中存在高度變異，但其兩側(cè)的序列一般是相對保守的單拷貝序列，根據(jù)這一特征設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而可以將單個微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來。由于重復(fù)單元的重復(fù)數(shù)目不同就產(chǎn)生擴(kuò)增片段長度的多態(tài)性，從而形成分子標(biāo)記。核心引物（Core

Primers）從大量引物中篩選出的一組擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性較好、帶型分布合理、能夠用于區(qū)分不同材料遺傳背景差異的引物組合。DB

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5524—2022聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（

Chain

Reaction，）在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或片段的方法。4 儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備高速離心機(jī)；PCR

3000

V,

mA,

400

WDNA

天平（0.01

g,

0.001

g）；研缽或組織研磨儀；水浴鍋；通風(fēng)櫥；微量加樣器（

μL～10

μ

μL～

μL,

100

μL～1000

μLNanodrop2000500

，1000

mL）；離心管（

mL，2

mL吸頭

μL，200

μL，1000

μL)；96

孔

PCR

夾子等。試劑CTABβ-Tris

(

Na2

2O)40%非變性聚丙烯酰胺母液（）；四甲基乙二胺（）；過硫酸銨；硝酸銀；甲醛；乙醇。溶液配制DNA

提取及電泳相關(guān)試劑儲備液配制見附錄B。試劑配制所用水應(yīng)符合GB/T

6682規(guī)定的一級水的要求，其中銀染、顯影溶液的配制可以使用符合三級水的要求。5 樣品送樣送驗(yàn)樣品為種子，重量應(yīng)不低于500

g。試驗(yàn)樣品GB/T

3543.215是種子、胚芽、幼苗或葉片。6 方法步驟DNA

6.1.1

2

mL

800

μL

℃預(yù)熱的

2%

CTAB

DNA

提取液(配方見表

B.3)，渦旋震蕩

1

min。6.1.2 將離心管置于

℃水浴

min，每

min

顛倒混勻一次。將樣品從水浴鍋中取出，靜置片刻，加入

800

μL

氯仿與異戊醇的混合液（

:1

異戊醇），混勻

min，然后靜置

10

min，10000

r/min

室溫離心

10

min。6.1.3 取

600

μL

上清液于另一新的

2

離心管中，加入

μL

乙醇，-20

℃放置

30

。10000

r/min

10

min，倒掉上清液，留沉淀。6.1.4 加入

μL

75%乙醇，輕輕將沉淀彈起，10000

5

，倒掉上清液。6.1.5 重復(fù)步驟

6.1.4

一次。6.1.6 將離心管開口朝下傾斜放置，便于多余乙醇流出，室溫干燥

1

h

或

50

℃烘干

20

。加入150

μL

ddH2O

或

1×（配方見表

），置

℃水浴鍋溶解

1

h。

ng/μL）正向引物（2

/L反向引物（2μmol2×UTaq

10ddH220

Utaq

MgCl2

95

95

30

55

45

72

45

35

72

10

DB

13/T

5524—20226.1.7 取出離心管，放置至室溫，10000

r/min

離心

2

，將上清液吸取到新的

mL

離心管中，以便去除淀粉等沉淀物。6.1.8 利用超微量核酸蛋白檢測儀進(jìn)行

DNA

OD260

與

的比值應(yīng)介于1.7～

之間，并稀釋到

20

ng/μL

。PCR

6.2.1 PCR

反應(yīng)體系利用本標(biāo)準(zhǔn)附表中給出的對綠豆核心引物對受檢樣品

及標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA進(jìn)行

擴(kuò)增。在冰盤中或4

℃條件下按表

1

所列成分和用量,

依次加入PCR管,

準(zhǔn)備反應(yīng)體系。表

1

反應(yīng)體系6.2.2 PCR

反應(yīng)程序按表

2

程序設(shè)置6.2.2 PCR

反應(yīng)程序表

2

反應(yīng)程序PCR

產(chǎn)物電泳分析6.3.1PCR

產(chǎn)物電泳分析電泳采用

mm×

mm,

自來水漂洗干凈,

然后用蒸餾水沖洗,最后用75%

乙醇擦拭,

并空置晾干。6.3.2 膠板制備采用8%（）非變性聚丙烯酰胺凝膠，其配制方法見附錄B表（表）。取

mL

（）TEMED

40

μL，10%過硫酸銨400

μL齒高通量制膠梳，放置20

min

以上，以便凝膠完全凝固。DB

13/T

5524—20226.3.3 電泳×TBE1

μLPCR

marker（最小片段

V30W；電泳時間根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小進(jìn)行調(diào)整，一般可在二甲苯青指示劑條帶剛剛跑出膠板時停止電泳。6.3.4 銀染下板后將凝膠從玻璃板上取下，用蒸餾水沖洗凝膠1～2次，以洗掉殘留的電泳緩沖液。用終濃度為

%（w/w）的AgNO3染色液染色

10

min。6.3.5 顯影用蒸餾水沖洗凝膠1～2次，然后使用1.5

%（）NaOH0.5%5

～min，然后用蒸餾水充分漂洗凝膠，終止顯色反應(yīng)。6.3.6 電泳結(jié)果記錄和分析6.3.6.1 DNA

Marker

引物從標(biāo)準(zhǔn)樣品和檢測樣品中擴(kuò)增出的條帶數(shù)及其分子量大小，按“有”對應(yīng)條帶記錄為“

1

”，“無”對應(yīng)條帶記錄為“

0

”的方法記錄每對

SSR

引物的

擴(kuò)增結(jié)果。在引物等位變異片段大小范圍內(nèi)（見表A.1）,特異譜帶呈現(xiàn)單譜帶或2異性擴(kuò)增還是新增的稀有等位變異。采用單個個體擴(kuò)增的產(chǎn)物，出現(xiàn)3種或3種以上的多帶則為非特異性擴(kuò)增；采用混合試樣提取的，某些位點(diǎn)出現(xiàn)33種以上的譜帶，則需要通過單個個體進(jìn)行甄別。6.3.6.2 樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品逐個位點(diǎn)比較，確定差異位點(diǎn)。6.3.6.3品種純度采用包括序號12、30的引物在內(nèi)的102個以上位點(diǎn)與其他個體存在差異時，為非典型個體。7 結(jié)果判斷與計(jì)算抗豆象綠豆品種真實(shí)性判斷利用附錄A中30個SSR標(biāo)記對樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳分析的結(jié)果，計(jì)算差異位點(diǎn)數(shù)量，核實(shí)差異位點(diǎn)編號。檢測結(jié)果用樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的位點(diǎn)差異數(shù)表示。若在所檢測的個SSR標(biāo)記中：a)

受檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品差異標(biāo)記數(shù)≧2，判讀為不同品種；b)

受檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品差異標(biāo)記數(shù)=1，判讀為近似品種；c)

受檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品差異標(biāo)記數(shù)=0，判讀相同或極近似品種。品種純度計(jì)算檢測結(jié)果使用正常個體數(shù)目（檢測試樣總數(shù)減去非典型個體數(shù)目）占檢測試樣總數(shù)的百分率表示，按式1計(jì)算品種純度。P=(1???/??)×100%

…………(1）式中：P——受檢樣品品種純度；S——非本品種特征譜帶粒數(shù)；T

受檢樣品總粒數(shù)。8結(jié)果報告8.1 真實(shí)性鑒定按照GB/T

報：DB

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5524—2022a)

通過

8%（w/w與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較未能檢測出位點(diǎn)差異；b)

通過 對引物，使用混合試樣，采用

（）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進(jìn)行檢測，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較檢測出差異位點(diǎn) 個，差異位點(diǎn)的引物編號為 。8.2 純度測定按照GB/T

的檢驗(yàn)報告要求，對品種純度的檢測結(jié)果按下列方式進(jìn)行填報，即：通過編號為 （出其他類型雜株 個，品種純度為 %。5'-3'5'-3'/bpsyd2155180-248syd725510110-158syd1025510124-160syd11455134-171syd16950169-249syd1815011124-184syd26150125-155syd31650170-210syd35850190-25710syd361TC50146-18611syd387TT50215-26512syd404GC55144-18413syd431CG50201-24114syd510CAA50154-19415syd550ACCAGA5011216-26616syd643CCTCTGCCTC55216-256DB

13/T

5524—2022

附 錄A（資料性）SSR

標(biāo)記信息表A.1規(guī)定了30對綠豆SSR核心引物及相關(guān)信息。表

表

A.1

SSR

標(biāo)記引物信息5'-3'5'-3'/bp17syd648GTCCAGGAGG55235-28518syd672GT50153-19319syd747TC5011183-22320syd753AA50325-37521syd856GTTT55248-28822syd934CA50270-31023syd1083AT55276-31624syd1145CC50147-19725syd1159TG55130-17026syd1303AC50117-15727syd1435AC55148-19828syd1470CA50173-21329syd1652AC50132-17230Mchr5-163TT55171-211

syd404

DB

13/T

5524—2022表

表

A.1

SSR

標(biāo)記引物信息（續(xù)）CTAB20

NaCl81.82

2

100

0.5

緩沖液（40

mL

1000

mL

2

mL

121.1

ddH2800

2

37%42

mL

42

1000

mL

2

mL

190.5

緩沖液（

ddH2484

500

Na2

-2H2186.1

ddH2700

10

NaOH50

mL

50

10

pH

1000

mL

2

mLDB

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5524—2022

附錄B（規(guī)范性）DNA

提取及電泳相關(guān)試劑儲備液表B.1至表給出了DNA

提取及電泳相關(guān)試劑儲備液。表

B.1 1.0mol/L表

B.1 1.0mol/L

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸貯備液(

Tris-HCl

貯備液)（pH8.0，1000

mL）表

B.2

（pH8