醫(yī)學(xué)熒光定量PCR

主

要

內(nèi)

容?定量PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別?熒光定量PCR的原理?常用的熱循環(huán)儀?定量的方法?重復(fù)性和敏感度?應(yīng)用?如何設(shè)計(jì)熒光定量PCR的方案熒光定量PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析熒光定量PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn)特異性更強(qiáng)靈敏度高可直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量解決PCR污染問(wèn)題自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單real

time

PCR的擴(kuò)增曲線Ct值極具重現(xiàn)性PE公司在同一臺(tái)PCR儀上對(duì)相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖Ct與初始模板的關(guān)系·

固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比固定熒光信號(hào)值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比初始DNA量越多,熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少起始模板的對(duì)數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出104

103102Threshold常用的熒光定量PCR試劑SYBR

Green

ITaqman水解探針?lè)肿有艠?biāo)SYBR

Green

I·結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位·只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光SYBR

Green

I

工作原理未結(jié)合的SYBR

green

I結(jié)合解離曲線識(shí)別不同的PCR產(chǎn)物95℃15sec;

60℃

20sec;

95

℃15sec在60℃～95℃之間的Ramp

time設(shè)為19:59SYBR

Green

I的特點(diǎn)√可以用于不同的模板√使用方便，價(jià)格相對(duì)便宜√靈敏度很高√與非特異性產(chǎn)物結(jié)合√解離曲線√選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反應(yīng)條件TaqMan

Probes熒光素與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTETJOEHEXVIC淬滅劑TAMRADABCYLTaqMan

Probes工作原理探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，發(fā)生

FRET能量轉(zhuǎn)移Taq熒光基團(tuán)淬滅劑游離的探針光延伸時(shí)，Taq酶水解探針，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號(hào)Taq發(fā)出熒光光另一波長(zhǎng)的熒光隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，TaqMan探針釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系TaqMan探針應(yīng)用基因檢測(cè)、病毒定量、細(xì)胞因子基因定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測(cè)等其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性但只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)TaqMan

MGB探針熒光素非熒光淬滅基團(tuán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)MGB(Minor

Groove

Binder)將探針的Tm值提高10℃因此，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。TaqMan

MGB探針對(duì)于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。分子信標(biāo)(發(fā)夾型雜交探針)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成淬滅劑莖(5-7bp)環(huán)（15-30bp） 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTexas

Red探針雜交到DNA模板光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)DNA模板莖淬滅劑分子信標(biāo)工作原理環(huán)光淬滅分子信標(biāo)能特異性地檢測(cè)感興趣的目標(biāo)DNA分子信標(biāo)可用于單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)特別適用于檢測(cè)點(diǎn)突變只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格較高常用的熱循環(huán)儀Company

PCR

systemSampleformatMaxsamplenumberApplied

BiosystemsABI

Prism

7700

SDSGeneAmp

5700

SDSABI

Prism

7900

HTSDSMicroplateTubesMicroplateTubesMicroplate969696,

384iCycler

iQSmart

CyclerMicroplateTubesTubes969616Bio-Radwww.bio-CepheidCorbett

ResearchRotor-GeneTubes

Strip

tubes3272ABI

Prism

7700o可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因分子進(jìn)行擴(kuò)增一次可以測(cè)定96個(gè)樣本，并且速度較快，一批樣

本的完成只需要2～3小

時(shí)用于水解探針、雙鏈

DNA結(jié)合染料、分子信標(biāo)的分析定量——絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法標(biāo)準(zhǔn)品：純化的質(zhì)粒dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)系列并且注意其穩(wěn)定性，最好分裝后保存于-80℃熒光材料：雜交探針、水解探針或SYBRGreen

I不可以使用DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)RNA進(jìn)行定量應(yīng)用于定量病毒荷載量等定量——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)對(duì)照基因，用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和內(nèi)對(duì)照基因的量，再將目的基因的同內(nèi)對(duì)照基因的比值作為定量的最后結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品：含有目標(biāo)基因的DNA或RNA一般選用看家基因校正常選擇看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假設(shè)樣品逆轉(zhuǎn)錄效率相同的前提下，可以使用

DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)RNA進(jìn)行定量較常用的一種方法比較Ct法假設(shè)目的基因與看家基因擴(kuò)增效率相同，數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出目的基因的量=2-ΔΔCtΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照2-ΔΔCt表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)在目的基因與看家基因擴(kuò)增效率相同的情況下可以直接得到的目的基因相對(duì)于管家基因的定量，而不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線更為簡(jiǎn)便省時(shí)，也是相當(dāng)可靠的重

復(fù)

性

問(wèn)

題判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)劣的重要指標(biāo)主要判斷指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）影響結(jié)果重復(fù)性的因素PCR反應(yīng)擴(kuò)增的效率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到最佳擴(kuò)增效率目的基因的初始濃度使用初始濃度具有較高數(shù)量級(jí)的樣本或作平行孔標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測(cè)樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性：質(zhì)粒DNA或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA影

響

敏

感

度

的

因

素反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響可以用水解探針代替SYBRGreenI，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍?？梢允褂脽釂?dòng)辦法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進(jìn)行擴(kuò)增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開(kāi)始進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)數(shù)應(yīng)

用對(duì)各種基因表達(dá)進(jìn)行定量分析基礎(chǔ)研究：不同組織、用藥前后、不同發(fā)育階段基因表達(dá)······

差異的檢測(cè)臨床：細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等病原體的檢測(cè)

DNA、mRNA病毒荷載量的定量腫瘤相關(guān)基因、腫瘤標(biāo)志物和腫瘤耐藥基因的檢測(cè)食品衛(wèi)生檢疫：轉(zhuǎn)基因食品瘟疫流行地區(qū)進(jìn)口的食品·

點(diǎn)突變分析和等位基因分析如何設(shè)計(jì)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案根據(jù)擬要研究的基因名稱(chēng)，在genebank中找到相應(yīng)的基因序列（）采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer

Express2.0(Taqman探針或SYBR

Green

I，說(shuō)明見(jiàn)

/support/apptech

)和beacon

designs3.0進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)軟件可在下載?PCR產(chǎn)物大小在50-150bpTaqMan

探針設(shè)計(jì)原則保持G-C含量在30-80%之間避免同一堿基重復(fù)過(guò)多。特別是G，不可超過(guò)4個(gè)及以上5’不能是G盡量使探針中的C多于G上述兩條如果不能滿(mǎn)足，則使用互補(bǔ)鏈上的探針對(duì)于單探針?lè)磻?yīng)，用Primer

Express軟件計(jì)算出來(lái)的Tm值應(yīng)當(dāng)在68-70℃之間，比引物高10℃。長(zhǎng)度<30bp引

物

設(shè)

計(jì)

原

則在探針確定以后再選擇引物引物要盡可能地接近探針，但是不要重疊保持G-C含量在30-80%之間避免同一堿基重復(fù)過(guò)多。特別是G，不可超過(guò)4個(gè)及以上用Primer

Express軟件計(jì)算出來(lái)的Tm值應(yīng)當(dāng)在58-60℃之間3’的5個(gè)堿基中G和/或C堿基的總數(shù)不能超過(guò)2個(gè)引物和探針的設(shè)計(jì)原則的重要程度由上往下越來(lái)越低如果是設(shè)計(jì)SYBR

Green

I引物，也要選擇TaqMan

Primer

and

Probe

design并遵守這些規(guī)則，但是只需要合成引物就可以了。為了確保引物和探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)由非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。如何設(shè)計(jì)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案根據(jù)儀器和個(gè)人的喜好，確定熒光定量PCR的方法，選擇熒光素的種類(lèi)合成引物和探針收集樣品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反復(fù)凍融）制備標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)粒、化學(xué)合成的目的基因）· 拷貝數(shù)=質(zhì)量÷分子量×6.0×1023· 標(biāo)準(zhǔn)曲線通常由4～5個(gè)點(diǎn)組成配制好的引物和探針，保存于-20℃，注意避光保存探針RT反應(yīng)如何設(shè)計(jì)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案不加探針的常規(guī)PCR反應(yīng)，驗(yàn)證引物是否合適、模板是否降解、模板純度是否合適。同時(shí)確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)置陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)平行孔數(shù)據(jù)分析——基線和閾值的設(shè)定√確定正確的基線√設(shè)定合適的閾值注意：同樣的實(shí)驗(yàn)最好使用同樣的基線和閾值，這樣可以增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。但是閾值和基線不能被保存，因此必須記錄基線的缺省值在3～15循環(huán)閾值的缺省值是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍雙擊Y軸，將圖轉(zhuǎn)化為線圖，確定最先出現(xiàn)的反應(yīng)是否出現(xiàn)在15個(gè)循環(huán)后，如果是出現(xiàn)在15個(gè)循環(huán)后，那么不需要調(diào)整基線高豐度靶基因經(jīng)常在PCR循環(huán)早期開(kāi)始擴(kuò)增需要調(diào)整基線的循環(huán)終止值先將基線終止循環(huán)數(shù)定為6，單擊Update然后確定第一個(gè)檢測(cè)到擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)（比第一個(gè)檢測(cè)到擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)少1或2個(gè)循環(huán)的數(shù)量）將基線終止循環(huán)數(shù)定為8雙擊Y軸，將圖轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)圖不正確的基線設(shè)置基線終止循環(huán)數(shù)太低基線終止循環(huán)數(shù)太高閾值的缺省值是基線熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍–可以將閾值線的光標(biāo)移到符合下列條件的擴(kuò)增曲線的位置：–指數(shù)擴(kuò)增的線性階段–精度最大–敏感性最大確定最佳閾值標(biāo)準(zhǔn)曲線法斜率的絕對(duì)值接近3.322R2接近1