基因工程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基因工程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)DNA重組分子的構(gòu)建及篩選檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理：Bt蛋白中的"Bt"是蘇云金芽孢桿菌"Bacillusthuringiensis"的縮寫(xiě)。"毒蛋白"是其產(chǎn)生的一種伴胞晶體，有時(shí)也稱(chēng)為"delta-endotoxin"，即學(xué)術(shù)刊物中中文所對(duì)應(yīng)“delta內(nèi)毒素〞?！岸鲸暿侵钙鋵?duì)特定的物種有毒性，并非對(duì)所有的生物體都有毒性。而且不同的Bt菌系產(chǎn)生的毒蛋白的特異性也不同。Cry14-4是從蘇云金芽孢桿菌中獲得的一中新的殺蟲(chóng)晶體蛋白樣基因，對(duì)棉鈴幼蟲(chóng)有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。實(shí)驗(yàn)步驟一．目的基因的獲得在NCBI網(wǎng)站上查找目的基因的核心序列1atgtatatggctgaaattaaacgtttagattattatttaggtgccttgccttttggtaat61ttttatgtagatgattgtgatactttaaaaaattttatagatagccttttagatggtaaa121ccttctacaatgaataatactcctctaacaggtaatgtaaatgttacaaatcaaagtgtt181actatcttagatgatttagattccatagcaaccctaaccccagaatatgtatatgataat241tatttttctaatgatacaagtactgaaaaaacttatcaaaccttatcttttgagaaagat301gtacaaacaacagttagtacaactgttacccatggattccaaattggagggaaacttgga361gctgaagtaaaaggaagtgtaagtattcctttcgttgcagatggtggggttactgtaagt421gcagaaatttctggacaatataatttttcttcagcagatacagaaacaacaacaacttct481caaaaattaattattccttctcagtccggtaacattcgacctggttatacaacaagggtt541caaattatgttagcaaaaattaatattccacaaacagcagttcatttttctggttctatg601tcaggaacagtacatcgggatccaatccctagtagtgtaataggtttggtagactacgat661ttatatgatgaagtaaggtctctagaaaataattgttcaaattcaacagtaggtagagat721acaggtttagtattaaataacgctaatcaaagtgtagatttttcaggaagtggatttttt781actggttcaattactgcatttaatttttatgtaaaaattactgaatatccaattaataat841tcttcccaagaaaatataagatggtactcaatagaaccaaaagtattaaatcaatcaatt901atacgacatcgttttccttcaaattcttctgtgaatacttgtaattgctaa2.根據(jù)所查序列運(yùn)用primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)3.確定適合引物的序列及位置,設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)及加保護(hù)堿基上游引物：5’CCCCGGGATGTATATGGCTGAAA3’Sma1下游引物：5’CGAGCTCTTAGCAATTACAAGTACC3’Sac1所選限制性?xún)?nèi)切酶酶切序列及酶切點(diǎn):Sma1:CCC↓GGGSac1:GAGCT↓C4.菌體培養(yǎng)：將獲得的蘇云金芽孢桿菌于YT液體培養(yǎng)基，于30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，獲得足夠的菌體。收集菌體(注意吸干多余的水分)。輔助裂解：如果是G+菌，應(yīng)先加溶菌酶100μg/mL50μL。37℃處理1h。運(yùn)用CTAB法提取DNA。將提取的DNA用PCR擴(kuò)增獲得目的片段。構(gòu)建克隆載體質(zhì)?！瞤EASY-T1質(zhì)?！尺B接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂平板〔LB固體培養(yǎng)基加Kan和Amp〕，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)后，菌檢〔M13引物〕。附圖：質(zhì)粒pEASY-T1圖譜原理：很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3’端加上一個(gè)突出的堿基A。pEASY-T1載體是一種已經(jīng)線(xiàn)性化的載體，載體每條鏈的3’端帶有一個(gè)突出的T。這樣，pEASY-T1載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對(duì)，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體中，形成含有目的片斷的重組載體。反響體系：T載體，T4DNA連接酶，連接酶緩沖液10xbuffer，無(wú)菌ddWater從菌檢正確的菌落上挑菌搖菌〔LB液體培養(yǎng)基加Kan和Amp〕12-16h后，提取質(zhì)粒，送去檢測(cè)。表達(dá)載體的構(gòu)建〔pBI121質(zhì)?！掣綀D：pBI121質(zhì)粒圖譜酶切體系：30°CTangoTMbuffer1XSma1Sac1將目的片段確定正確的T質(zhì)粒酶切，跑膠，切膠回收，獲得帶酶切位點(diǎn)的的目的片段，目的載體PBI121也進(jìn)行酶切，跑膠，切膠回收。將酶切片段和酶切后的載體連接。四．目的基因的檢測(cè)與篩選1.將表達(dá)載體運(yùn)用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂平板〔LB固體培養(yǎng)基加Kan〕，12-16h后，菌落PCR〔所設(shè)計(jì)的引物〕。2.從菌檢正確的菌落上挑菌搖菌〔LB液體培養(yǎng)基加Kan和Amp〕12-16h后，提取質(zhì)粒。進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將酶切驗(yàn)證結(jié)果正確的菌落的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，涂平板〔YEB固體培養(yǎng)基+Kan+Rif〕，長(zhǎng)出菌落后，菌檢〔所設(shè)計(jì)的引物〕，將菌檢正確的菌落挑菌，搖菌，