腹瀉性貝毒的危害與防治

腹瀉性貝毒的危害與防治

近年來(lái)，隨著藥物紅色高峰的發(fā)生，這對(duì)中國(guó)的海洋生態(tài)和漁業(yè)造成了重大影響。赤潮毒素嚴(yán)重威脅了海洋養(yǎng)殖和人類健康。腹瀉性貝毒(DiarrheticShellfishPoisoning,DSP)是由有毒赤潮藻類鰭藻屬(Dinophysis)和原甲藻屬(Prorocentrum)產(chǎn)生的一類脂溶性多環(huán)醚類天然化合物,主要成分是軟海綿酸(OkadaicAcid,OA)及其衍生物,能引起食用者腹瀉、惡心等。腹瀉性貝毒能激發(fā)磷酸化來(lái)控制大腸細(xì)胞內(nèi)鈉的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A和PP2A的強(qiáng)烈抑制劑,也是一種很強(qiáng)的促癌劑,能引起消化道腫瘤的發(fā)生。我國(guó)海產(chǎn)品特別是貝類受腹瀉性貝毒沾污越來(lái)越嚴(yán)重。目前,腹瀉性貝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色譜法以及一些免疫化學(xué)方法。小鼠生物法簡(jiǎn)便易行,適合于大規(guī)模、批量樣品的檢測(cè),但不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu),干擾大、不精確。高效液相色譜法(HPLC),特別是液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù),可準(zhǔn)確分析毒素的含量和種類,檢出限可低至ng/g,但樣品前處理繁瑣費(fèi)時(shí),且儀器昂貴。因此,建立快速、靈敏的赤潮毒素檢測(cè)方法,有利于開(kāi)展大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)和生物樣品監(jiān)測(cè)計(jì)劃,對(duì)推動(dòng)貝類毒素研究和保障人體健康十分重要。免疫化學(xué)方法是基于抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合的一種分析方法,具有靈敏度高,特異性強(qiáng),儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,方法易掌握,樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和大量樣本快速篩查,因而,近年在分析化學(xué)領(lǐng)域受到極大的重視且發(fā)展迅速?，F(xiàn)已有售德國(guó)、日本等公司生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)DSP的試劑盒。國(guó)內(nèi)已有關(guān)于OA抗體制備和ELISA檢測(cè)方法的報(bào)道,有關(guān)腹瀉性貝毒膠體金檢測(cè)方法的研究也有報(bào)道。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)應(yīng)用免疫層析技術(shù)用于分析DSP的報(bào)道。本文用膠體金標(biāo)記抗體,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng),研制快速檢測(cè)OA的免疫層析試紙條技術(shù),為我國(guó)腹瀉性貝毒監(jiān)測(cè)提供快速分析方法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1刀、玻璃器餅、試紙條模具BIODOT切割機(jī),XYZ-3000噴點(diǎn)儀購(gòu)自Biodot公司;JASCOV-550紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì);恒溫干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、試紙條模具均為國(guó)產(chǎn)。膠體金檢測(cè)用樣本墊(玻璃纖維素膜,10×300mm)、膠金墊(玻璃纖維素膜,8×300mm)、吸水紙(14×300mm)均購(gòu)自Millipore公司;硝酸纖維素膜(NC膜,25×300mm)購(gòu)自Sartorius公司。40nm膠體金,用1%檸檬酸三鈉水溶液燒制還原0.01%氯金酸水溶液,批量制備紫紅色的膠體金溶液,最大吸收波長(zhǎng)538nm,其它試劑均為分析純。1.3抗體標(biāo)記的確定1.3.1抗軟海綿酸單克隆抗體及包被抗原的制備本室自制OA-OVA偶聯(lián)抗原(4.65mg/mL)和抗OA-KLH單克隆抗體腹水,制備方法和性質(zhì)鑒定見(jiàn)參考文獻(xiàn)。1.3.2單克隆抗體腹水的純化用辛酸硫酸胺方法純化得到粗抗體,再用0.01mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)透析4～5d。用分光光度計(jì)測(cè)得抗體蛋白濃度為1.78mg/mL。1.3.3包被抗原濃度篩選OA-OVA偶聯(lián)抗原用PBS稀釋,稀釋倍數(shù)分別為原液、稀釋2倍、稀釋4倍,稀釋后點(diǎn)在NC膜上,37℃干燥1h備用?？乖瓏奛C膜:抗原用PBS稀釋4倍后用XYZ-3000噴點(diǎn)儀噴NC膜,噴量為:0.74μL/cm,Y=16cm,37℃干燥過(guò)夜,備用。1.3.4金標(biāo)抗體的制備抗體標(biāo)記量為20μg/mL。先取20mL40nm的膠體金于干凈的燒杯中,用1mmol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH值為8.2,加入抗體,使其在膠體金中濃度為20μg/mL,攪拌1h,加入膠體金1/10體積的10%牛血清白蛋白溶液,攪拌30min,5000r/min離心30min,取沉淀,用PBS復(fù)溶,約加入4mL緩沖液,用紫外分光光度計(jì)掃描膠體金特征吸收峰,確定膠體金OD值后用PBS緩沖液稀釋,使其OD值為5,分成100μL/管,插入點(diǎn)好各種抗原濃度的NC膜,觀察NC膜顯色情況,確定用稀釋4倍的抗原篩選抗體標(biāo)記濃度。抗體標(biāo)記量的選擇:按照金標(biāo)抗體的制備方法,標(biāo)記不同濃度的抗體量,分別為20、15、10、5μg/mL,配制適當(dāng)濃度,使其OD值為5,用XYZ-3000噴點(diǎn)儀將金標(biāo)抗體噴在膠金墊上,噴金量分別為10、8、6、4μL/cm,真空干燥2h,備用,抗體共計(jì)16個(gè)梯度條件。1.3.5貝類樣品處理方法貝類樣品的測(cè)定:取新鮮的扇貝,去殼,勻漿,取少許勻漿,加入OA標(biāo)準(zhǔn)品,使其含量為20μg/100g,取加標(biāo)勻漿,用4倍體積(m∶V=1∶4)的80%甲醇-水超聲萃取5min,離心,上清液用PBS稀釋3倍,在96孔加樣板上,加80μL/孔,另加80μL/孔PBS為對(duì)照。2結(jié)果與討論2.1金標(biāo)抗體條件和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的選擇腹瀉性貝毒免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理,樣本中軟海綿酸OA在流動(dòng)過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合,抑制了抗體和NC膜檢測(cè)線上OA-OVA偶聯(lián)抗原的結(jié)合。如果樣本中OA含量大于12ng/mL,檢測(cè)線不顯顏色,結(jié)果為陽(yáng)性;反之,檢測(cè)線顯紅色,結(jié)果為陰性。16個(gè)抗體條件的金墊,分別和稀釋4倍的NC膜組裝成試紙條,用PBS檢驗(yàn)顯色程度。結(jié)果顯色均很深。降低抗體標(biāo)記量,用稀釋4倍的NC膜檢測(cè)和調(diào)節(jié)抗體標(biāo)記量,經(jīng)過(guò)細(xì)微摸索抗原濃度,最后確定用PBS稀釋8倍的檢測(cè)抗原制備NC膜,0.74μL/cm。降低標(biāo)記量為5、4、3、2μg/mL,調(diào)制OD值為4、5、6,噴金量為2、2.5、3、3.5、4、6、8μL/cm,共84個(gè)金標(biāo)抗體條件和稀釋8倍的包被抗原NC膜組裝,分別用空白(0.01mmol/LPBS)、PBS稀釋的軟海綿酸OA標(biāo)準(zhǔn)品20、15、12、10ng/mL檢測(cè)顯色程度和陽(yáng)性抑制濃度。加樣量為80μL/孔,判斷時(shí)間為15min。最終選擇標(biāo)記量為:2μg/mL,OD為5,噴3μL/cm,組裝雙金墊,NC膜為原液稀釋8倍的抗原條件組裝成試紙條,檢出限為12ng/mL。重復(fù)性實(shí)驗(yàn):按照上述實(shí)驗(yàn)條件,重新標(biāo)記抗體并噴抗原,組裝條件一致的試紙條,檢測(cè)結(jié)果和原條件實(shí)驗(yàn)一致(圖1),空白液顯色一般(0號(hào)卡),陽(yáng)性12ng/mL完全抑制無(wú)條帶出現(xiàn)(8號(hào)卡)。貝類DSP毒素提取需要80%的甲醇-水溶液,有機(jī)溶劑會(huì)干擾抗原抗體反應(yīng),因此在PBS緩沖液中添加不同濃度甲醇實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:檢測(cè)樣本中含30%以下甲醇對(duì)免疫學(xué)反應(yīng)無(wú)影響。小鼠法陰性樣品驗(yàn)證了此結(jié)果(圖2)。小鼠法陽(yáng)性樣品有部分抑制,條帶顏色比空白淺(圖3)。對(duì)于加標(biāo)貝樣萃取液的測(cè)定結(jié)果表明,15min內(nèi)空白對(duì)照顯紅色條帶,而貝樣的萃取液(含OA16.7ng/mL)無(wú)顏色條帶出現(xiàn)。當(dāng)貝類勻漿用5倍體積的80%甲醇-水萃取時(shí)(含OA13.3ng/mL),實(shí)驗(yàn)結(jié)果在15min內(nèi)無(wú)顏色條帶出現(xiàn),但放置長(zhǎng)時(shí)間(大于2h)后,會(huì)出現(xiàn)極淺的條帶印跡。因此對(duì)于OA含量稍高于或接近于檢出限12ng/mL的樣品,一定要嚴(yán)格控制檢測(cè)時(shí)間,在15min內(nèi),與空白對(duì)照,得出結(jié)果,當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)由于極少量的金標(biāo)抗體抗原復(fù)合物的長(zhǎng)時(shí)間附著積累,以及其他一些非特異性吸附反應(yīng)等的作用,而干擾試驗(yàn)結(jié)果的判斷。2.2等價(jià)物測(cè)定一些國(guó)家規(guī)定的貝類組織中腹瀉性貝毒安全閾值是20μgOA等價(jià)物/100g貝肉,我國(guó)《有毒赤潮監(jiān)測(cè)嶄行規(guī)范》推薦20μgOA等價(jià)物/100g貝肉的限定值。應(yīng)用研制的靈敏專一的抗軟海綿酸單克隆抗體,研究建立的貝類腹瀉性貝毒主要成份軟海綿酸的免疫快速檢測(cè)卡(檢出限12ng/mL,時(shí)間15min),不需要任何儀器設(shè)備,完全滿足該規(guī)定閾值,應(yīng)用于貝類樣品中軟海綿酸的檢測(cè)。2.3聯(lián)免疫檢測(cè)方法免疫層析與酶聯(lián)免疫分析方法具有相似的原理,都是基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)而建立的免疫檢測(cè)技術(shù)。使用同一種抗體建立的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法比免疫層析檢測(cè)方法靈敏度高,但分析步驟多,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)(2.5h),定量檢測(cè)需使用酶標(biāo)儀完成;而免疫層析快速檢測(cè)方法雖然靈敏度低,但只使用一種試劑,一步操作,可在室溫長(zhǎng)期保存,具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染、不需任何檢測(cè)儀器的優(yōu)點(diǎn),特別適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)篩選陽(yáng)性樣品,然后使用色譜等儀器方法驗(yàn)證鑒定。對(duì)于半定量的快速現(xiàn)場(chǎng)篩選具有其他方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。2.4檢測(cè)方法的選擇本研究組曾制備抗OA-BSA單克隆抗體,由于特異性不高,最大抑制率只有30%,建立的免疫層析檢測(cè)方法靈敏度低,不具有可用于實(shí)際樣品檢測(cè)的使用價(jià)值;而本研究中使用的抗OA-KLH單克隆抗體,特異性高,最大抑制率可達(dá)到90%以上,因此使用其建立的免疫層析檢測(cè)方法靈敏度高,能夠滿足實(shí)際樣品安全規(guī)定值的檢測(cè)需要,建立的分析方法具有實(shí)用價(jià)值。結(jié)合率高的包被抗原。因?yàn)镺A是小分子,不能直接吸附到硝酸纖維膜上,必需偶聯(lián)到大分子蛋白載體上。偶聯(lián)的分子比是影響檢測(cè)方法成功的關(guān)鍵因素之一。噴點(diǎn)在檢測(cè)線上的包被抗原OA-OVA,必需具有較高的OA結(jié)合比,才能夠使得競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的金標(biāo)記抗體的量能夠產(chǎn)生肉眼可識(shí)別的顏色變化,而達(dá)到檢測(cè)的目的。建立一種物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的影響因素非常多。盡管在理論上已經(jīng)很成熟,可實(shí)際中成功率并不高,尤其對(duì)于小分子的間接競(jìng)爭(zhēng)方法,困難更多。這是一個(gè)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,涉及到