生物質(zhì)譜技術(shù)原理及應(yīng)用0327 (1)

生物質(zhì)譜技術(shù)原理及應(yīng)用揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心色質(zhì)譜機(jī)組王郁楊質(zhì)譜的概念質(zhì)譜分析法是通過(guò)對(duì)被測(cè)樣品離子的質(zhì)荷比（m/z）的測(cè)定來(lái)進(jìn)行分析的一種分析方法。它可用于未知化合物的鑒定、定量分析、分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)特性的確定等方面。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按質(zhì)荷比分開(kāi)而得到質(zhì)譜，通過(guò)樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展自1886年Goldstein發(fā)明早期質(zhì)譜儀器常用的離子源，到1942年第一臺(tái)單聚焦質(zhì)譜儀商品化，質(zhì)譜基本上處于理論發(fā)展階段。隨后質(zhì)譜在電離技術(shù)和分析技術(shù)上的發(fā)展和完善，使之很快應(yīng)用于地質(zhì)、空間研究、環(huán)境化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、制藥等多個(gè)領(lǐng)域。然而，即使在等離子體解吸（plasmadesorption,PD）和快原子轟擊（fastatombombardment,FAB）兩項(xiàng)軟電離質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)以后，質(zhì)譜分析的相對(duì)分子質(zhì)量也只是在幾千左右。生物質(zhì)譜真正意義上的變革以80年代中期出現(xiàn)的兩種新的電離技術(shù)為代表：

電噴霧電離（electrosprayionization,ESI）基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI）這兩種技術(shù)所具有的高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使得在fmol（10-15）乃至amole（10-18）水平檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)幾十萬(wàn)的生物大分子成為可能，從而開(kāi)拓了質(zhì)譜學(xué)一個(gè)嶄新的領(lǐng)域——生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用和發(fā)展，為蛋白質(zhì)組研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)手段。質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)和工作原理

質(zhì)譜分析法主要是通過(guò)對(duì)樣品的離子的質(zhì)荷比的分析而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量的一種方法。因此，質(zhì)譜儀必須有電離裝置把樣品電離為離子，有質(zhì)量分析裝置把不同質(zhì)荷比的離子分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)之后可以得到樣品的質(zhì)譜圖，不管是哪種類(lèi)型的質(zhì)譜儀，其基本組成是相同，包括離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器和真空系統(tǒng)。離子源離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。質(zhì)譜儀的離子源種類(lèi)很多，主要有：電子電離源(ElectronIonization,EI)化學(xué)電離源(ChemicalIonization,CI)快原子轟擊源(FastAtomicbombardment,FAB)電噴霧源(ElectronsprayIonization,ESI)大氣壓化學(xué)電離源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MatrixAssistedLaserDescriptionIonization,MALDI)電噴霧源(ESI源)

利用高電場(chǎng)使質(zhì)譜進(jìn)樣段的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫(kù)倫斥力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過(guò)程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈霧滴狀，這時(shí)的液滴表面電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。（如下圖）流出液在高電場(chǎng)下形成帶電噴霧，在電場(chǎng)力作用下穿過(guò)氣簾；氣簾的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子

電噴霧電離源是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會(huì)在電離過(guò)程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物，如蛋白質(zhì)、肽、糖等。電噴霧電離源的最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子。這樣，一個(gè)分子量為10KD的分子若帶有10個(gè)電荷，則其質(zhì)荷比只有1000，進(jìn)入了一般質(zhì)譜儀可以分析的范圍之內(nèi)。根據(jù)這一特點(diǎn)，目前采用ESI，可以測(cè)量分子量在300KD以上的蛋白質(zhì)。MALDI離子源

待測(cè)物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長(zhǎng)的脈沖式激光（337nm的氮激光）進(jìn)行照射時(shí)，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。質(zhì)量分析器

質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開(kāi)并排列成譜。質(zhì)量分析器有

A、磁式單聚焦分析器(SingleFocusing)B、磁式雙聚焦分析器(DoubleFocusing)

C、四極桿分析器(Quadrupole)D、離子阱分析器(IonTrap)E、飛行時(shí)間分析器(TimeofFlight)F、傅立葉變換回旋共振分析器(FourierTransformIonCyclotronResonance,FTICR）四極桿分析器由兩對(duì)四根高度平行的金屬電極桿組成的，精密地固定在正方形的四個(gè)角上，其中一對(duì)電極加上直流電壓Vdc，另一對(duì)電極加上射頻電壓V0cosωt（V0為射頻電壓的振幅，ω為射頻振蕩頻率，t為時(shí)間），即加在兩個(gè)極桿之間的總電壓為（Vdc+V0cosωt）。由于射頻電壓大于直流電壓，所以在四極之間的空間處于射頻調(diào)制的直流電壓的兩種力作用下的射頻場(chǎng)中，離子進(jìn)入此射頻場(chǎng)時(shí)，只有合適m/e的離子才能通過(guò)穩(wěn)定的振蕩穿過(guò)電極間隙而進(jìn)入控制器，其它m/e的離子則與極桿相撞而被濾去。只要保持Vdc/V0值及射頻頻率不變，改變Vdc、V0可以實(shí)現(xiàn)掃描。

是一種無(wú)磁分析器，體積小，重量輕，操作方便，掃描速度快，分辨率較高。是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比

(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比。反射飛行時(shí)間質(zhì)量檢測(cè)器飛行時(shí)間分析器

飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的主要部分是一個(gè)離子漂移管。離子在加速電壓V作用下得到動(dòng)能，則有：

1/2mv2=eV或v=(2eV/m)1/2離子以速度v進(jìn)入自由空間（漂移區(qū)），假定離子在漂移區(qū)飛行的時(shí)間為T(mén)，漂移區(qū)長(zhǎng)度為L(zhǎng)，則：

T=L(m/2eV)1/2

可以看出，離子在漂移管中飛行的時(shí)間與離子質(zhì)量的平方根成正比。也即，對(duì)于能量相同的離子，離子的質(zhì)量越大，達(dá)到接收器所用的時(shí)間越長(zhǎng)，質(zhì)量越小，所用時(shí)間越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子分開(kāi)。適當(dāng)增加漂移管的長(zhǎng)度可以增加分辨率。

飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的特點(diǎn)：質(zhì)量范圍寬，掃描速度快，既不需電場(chǎng)也不需磁場(chǎng)。但是，長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)一直存在分辨率低這一缺點(diǎn)，造成分辨率低的主要原因在于離子進(jìn)入漂移管前的時(shí)間分散、空間分散和能量分散。這樣，即使是質(zhì)量相同的離子，由于產(chǎn)生時(shí)間的先后，產(chǎn)生空間的前后和初始動(dòng)能的大小不同，達(dá)到檢測(cè)器的時(shí)間就不相同，因而降低了分辨率。目前，通過(guò)采取激光脈沖電離方式，離子延遲萃取技術(shù)和離子反射技術(shù)，可以在很大程度上克服上述三個(gè)原因造成的分辨率下降?，F(xiàn)在，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的分辨率可達(dá)20000以上。最高可檢質(zhì)量超過(guò)300000Da，并且具有很高的靈敏度。MALDI-TOF檢測(cè)器

質(zhì)譜儀的檢測(cè)主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。由四極桿出來(lái)的離子打到高能打拿極產(chǎn)生電子，電子經(jīng)電子倍增器產(chǎn)生電信號(hào)，記錄不同離子的信號(hào)即得質(zhì)譜。真空系統(tǒng)

為了保證離子源中燈絲的正常工作，保證離子在離子源和分析器正常運(yùn)行，消減不必要的離子碰撞，散射效應(yīng)，復(fù)合反應(yīng)和離子-分子反應(yīng)，減小本底與記憶效應(yīng),因此，質(zhì)譜儀的離子源和分析器都必須處在優(yōu)于10-5mbar的真空中才能工作。一般真空系統(tǒng)由機(jī)械真空泵和擴(kuò)散泵或渦輪分子泵組成。機(jī)械真空泵能達(dá)到的極限真空度為10-3mbar,不能滿足要求，必須依靠高真空泵。擴(kuò)散泵是常用的高真空泵，其性能穩(wěn)定可靠，缺點(diǎn)是啟動(dòng)慢，從停機(jī)狀態(tài)到儀器能正常工作所需時(shí)間長(zhǎng)；渦輪分子泵則相反，儀器啟動(dòng)快，但使用壽命不如擴(kuò)散泵。但由于渦輪分子泵使用方便，沒(méi)有油的擴(kuò)散污染問(wèn)題，因此，近年來(lái)生產(chǎn)的質(zhì)譜儀大多使用渦輪分子泵。渦輪分子泵直接與離子源或分析器相連，抽出的氣體再由機(jī)械真空泵排到體系之外。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜儀是一種很好的定性鑒定用儀器，對(duì)混合物的分析無(wú)能為力。色譜儀是一種很好的分離用儀器，但定性能力很差。二者結(jié)合起來(lái)，則能發(fā)揮各自專長(zhǎng)，使分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行(色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)。這樣，使質(zhì)譜儀無(wú)論在定性分析還是在定量分析方面都十分方便。同時(shí)，為了增加未知物分析的結(jié)構(gòu)信息，為了增加分析的選擇性，采用串聯(lián)質(zhì)譜法(質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用)，也是目前質(zhì)譜儀發(fā)展的一個(gè)方向。MALDI-TOFMSMALDI-TOF-TOFMSESI-Q-Q-QMSESI-ITMSESI-IT-TOFMSESI-Q-TOFMSESI-FTICRMS生物質(zhì)譜

目前商業(yè)化的生物質(zhì)譜儀主要是：液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-ESI-MS-MS）與帶有串聯(lián)質(zhì)譜功能的MALDI-TOF質(zhì)譜儀。前者是在傳統(tǒng)的電噴霧質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上采用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器代替四極桿質(zhì)量分析器，大大提高了儀器的分辨率、靈敏度和質(zhì)量范圍，其商品名有Q-TOF和Q-STAR等；后者是在質(zhì)譜中加入了源后降解（post-sourcedecay,PSD）模式或碰撞誘導(dǎo)解離（collisionallyinduceddissociation,CID）模式，從而使生物大分子的測(cè)序成為可能。

ESI-MS可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等現(xiàn)代化的分離手段聯(lián)用，從而大大擴(kuò)展了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用等。MALDI-TOF-MS的特點(diǎn)是對(duì)鹽和添加物的耐受能力高，且測(cè)樣速度快，操作簡(jiǎn)單。此外，可用于生物大分子測(cè)定的質(zhì)譜儀還有離子阱質(zhì)譜和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等。質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)組學(xué)的定義和基礎(chǔ)知識(shí)2、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)學(xué)中重要應(yīng)用蛋白質(zhì)鑒定

差異表達(dá)

蛋白質(zhì)定量什么是蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模研究蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)這個(gè)概念是相對(duì)應(yīng)于基因組學(xué)產(chǎn)生的，而且通常被視為是基因組學(xué)的下一步，且復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出基因組學(xué)。更重要的是，基因組的存在是相對(duì)穩(wěn)定的，而細(xì)胞和細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組則是隨蛋白質(zhì)和基因以及環(huán)境的生物化學(xué)反應(yīng)而變化的。同一生物在生物體的不同部位、生命的不同時(shí)期以及不同的環(huán)境中，具有不同的蛋白質(zhì)表達(dá)。MALDI源生物質(zhì)譜

MALDI-TOF-MS

基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）SampleInletIonizationMassAnalyzerMassSorting(filtering)IonDetectorDetectionIonSourceSample/MatrixdriedonMALDIPlate(AutoloaderCassette)DetectionsFormsions(chargedmolecules)SortIonsbyMass(m/z)BasicComponentsofaMassSpectrometerDataProcessingVacuumEnvelopeRelativeAbundancem/z

1000

2000MassSpectrumDataSystemMALDI離子源

待測(cè)物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長(zhǎng)的脈沖式激光（337nm的氮激光）進(jìn)行照射時(shí)，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。MALDI基質(zhì)應(yīng)具有的特性能夠嵌入樣品分子間并能起到隔離樣品分子之間的相互作用(如形成共結(jié)晶);能溶解于可溶解樣品分子的溶劑;在真空狀態(tài)下是穩(wěn)定的;可吸收激光,既與激光形成共振吸收;可激發(fā)樣品分子離子化.

常用的MALDI基質(zhì)MatrixApplication2,5-Dihydroxybenzoicacid(DHB)2,5-二羥基苯甲酸Smallmolecules,smallpeptides,nucleotides,oligonucleotides,oligosaccharides3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid(SA)3,5-二甲氧基－４－羥基肉硅酸(反式)

Largepeptides,wholeproteins,glycoproteins,lipidsa-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(CHCA)?。婊矗u基肉硅酸Peptides,proteins,lipids,nucleotides是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比

(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比。反射飛行時(shí)間質(zhì)量檢測(cè)器飛行時(shí)間分析器TOF-TOFMALDI-TOF/TOFMALDI源可以電離分子質(zhì)量為102～106Da的生物分子并用于質(zhì)譜分析。MALDI產(chǎn)生的離子采用飛行時(shí)間（TOF）檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)，因此適用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的測(cè)定。通過(guò)第一級(jí)TOF選擇特定多肽和蛋白，而后送入碰撞池進(jìn)行裂解，再進(jìn)入第二級(jí)TOF進(jìn)行序列和修飾等結(jié)構(gòu)解析，完成蛋白質(zhì)的精確鑒定。根據(jù)測(cè)定蛋白質(zhì)酶解后的肽質(zhì)量指紋圖譜、肽序列標(biāo)簽以及一級(jí)質(zhì)譜（MS）結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）法去檢索核酸或蛋白質(zhì)序列庫(kù)，可達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)的快速鑒定和高通量篩選。LCMALDITOF/TOF分析與ABSCIEXTOF/TOF?5800系統(tǒng)5800MALDITOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜主機(jī)TempoLCMALDI點(diǎn)樣系統(tǒng)Mascot2.3結(jié)合MascotDeamon搜索引擎ProteinPilot4.0蛋白分析工具TempoLCMALDI點(diǎn)樣系統(tǒng)MALDI的特點(diǎn)圖譜相對(duì)簡(jiǎn)單;激光具有一定的頻率，和TOF完美匹配;理論上待測(cè)物沒(méi)有分子量范圍限制;樣本消耗量極小(0.5μL);樣本點(diǎn)靶后可多次分析;一次實(shí)驗(yàn)可迅速完成多個(gè)不同樣本的分析，高通量;缺點(diǎn)

質(zhì)荷比500-800區(qū)域噪音較大；和液相色譜在線連接使用較為困難可以吸收激光能量發(fā)生變化的分子不適用MALDI優(yōu)點(diǎn)基于凝膠分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)或者條帶的鑒定

(2-DE,DIGE,Co-IP,GSTpulldown...)運(yùn)用質(zhì)譜進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)

(iTRAQ,SILAC,ICAT...)生物大分子的分子量分析蛋白質(zhì)的序列分析，肽段的從頭測(cè)序蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析

(磷酸化，糖基化...)有機(jī)小分子(>1000)與高聚物分子(基質(zhì)合適)分析MALDI源生物質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)的應(yīng)用雙向電泳切膠酶解肽提取點(diǎn)靶5800數(shù)據(jù)采集進(jìn)靶一級(jí)圖譜二級(jí)圖譜二級(jí)匹配圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索FEFAPVDTIDEEGTNTVK115/114＝1.0502匹配肽GlutathioneS-transferase

115/114＝1.0054鑒定的蛋白質(zhì)Western-bloting驗(yàn)證ProteinPilot?Software2-DE路線適用于質(zhì)譜的染色方法熒光染色（SYPRO?Rubyproteingelstain）考馬斯亮蘭染色（Bio-Safe?Coomassie?colloidal250stain）銀染（SilverStainPlus?stain）一級(jí)圖譜二級(jí)圖譜TrypsindigestionLC-MALDISDSiTRAQ路線iTRAQ+LC-MALDI+5800+ProteinPilot樣品標(biāo)記試劑數(shù)據(jù)分析軟件數(shù)據(jù)采集質(zhì)譜液相分離點(diǎn)靶系統(tǒng)iTRAQ試劑LC-MALDI液相點(diǎn)靶系統(tǒng)ABSCIEXTOF/TOF5800標(biāo)記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型”或“重型”；細(xì)胞處理、裂解、提取蛋白質(zhì)；

等量混合對(duì)照與處理組蛋白質(zhì)、SDS電泳、染色；

割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。細(xì)胞代謝標(biāo)記（SILAC）免疫共沉淀（Co-IP）GSTpulldown蛋白質(zhì)與核酸相互作用鑒定蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白-配體復(fù)合物研究生物大分子的分子量分析BSA某蛋白聚合體有機(jī)小分子研究數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Mascot2.3結(jié)合MascotDeamon搜索引擎ProteinPilot4.0蛋白分析工具一級(jí)圖譜二級(jí)圖譜MascotDeamonMascotDeamonProteinPilot使用Paragon算法同時(shí)搜索幾百種種生物修飾及其它修飾、遺傳變異、以及未預(yù)期的裂解方式，不會(huì)增加出現(xiàn)假陽(yáng)性的幾率，也不會(huì)延長(zhǎng)搜索時(shí)間或是增加多級(jí)分析的復(fù)雜性。使用嵌入式ProGroupTM算法進(jìn)行蛋白group分析，可區(qū)分蛋白異構(gòu)體，蛋白子集，并抑制假陽(yáng)性。定量工作流程-為iTRAQTM、ICAT?和SILACTM試劑工作流程提供優(yōu)化支持，包括4標(biāo)（4plex）、8標(biāo)（8plex）試劑，和用于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證的新型試劑mTRAQ。使用反庫(kù)（decoy）搜索進(jìn)行自動(dòng)化且嚴(yán)密的假陽(yáng)性率（FalseDiscoveryRate，F(xiàn)DR）分析，可為您的結(jié)果提供高級(jí)別的質(zhì)量控制。MALDI樣品基本要求磷酸鹽緩沖液<50mM重碳酸銨<30mMTrisbuffer<100mM胍(鹽酸鹽,硫酸鹽)<1MTriton<0.1%SDS<0.01%堿金屬鹽<1M甘油<1%蛋白樣品具體要求挖點(diǎn)或膠內(nèi)酶解操作過(guò)程中不可使用劣質(zhì)國(guó)產(chǎn)槍頭和指形管，防止塑料峰污染樣品防止角蛋白污染膠粒大?。?.5mm3以下膠內(nèi)酶解試劑（色譜級(jí)）染色方法：考染/銀染（銀染試劑中不能含有戊二醛）種屬名稱，搜庫(kù)要求（參數(shù)）LC-MALDI的樣品中不要含有乙腈，最好進(jìn)行過(guò)除鹽步驟UHR-TOFmaXis超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀儀器型號(hào)：maXis制造廠商：德國(guó)Bruker公司質(zhì)譜類(lèi)型：四級(jí)桿-飛行時(shí)間主要技術(shù)指標(biāo)：質(zhì)量范圍：m/z50～2500質(zhì)譜功能：MS，MS/MS分辨率：>50000(ESI+,m/z=1222)；>45000(ESI-,m/z=1334)MS質(zhì)量準(zhǔn)確度：優(yōu)于0.8ppm(全掃描，ESI+,m/z=1222，內(nèi)標(biāo)校正)優(yōu)于2ppm(全掃描，ESI+,m/z=1222，外標(biāo)校正)MS/MS質(zhì)量準(zhǔn)確度：優(yōu)于2ppm(外標(biāo)校正)同位素豐度比：平均豐度比誤差小于2%(調(diào)諧標(biāo)樣)掃描方式：一級(jí)質(zhì)譜全掃描(MS)，二級(jí)質(zhì)譜全掃描(MS/MS)電噴霧源(ESI源)

利用高電場(chǎng)使質(zhì)譜進(jìn)樣段的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫(kù)倫斥力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過(guò)程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈霧滴狀，這時(shí)的液滴表面電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。

ESI源質(zhì)譜技術(shù)如果樣品具有容易接收H+

的功能團(tuán)(例如氨基化合物、肽和蛋白質(zhì)上所帶的氨基)，那么使用正離子檢測(cè)法。如果樣品具有容易失去H+

的功能團(tuán)(例如羧酸、核酸和糖上所帶的羥基)，那么使用負(fù)離子檢測(cè)法。儀器功能及附件：1)離子源：配有ESI電噴霧電離源、APCI大氣壓化學(xué)電離源、nanoESI納升電噴霧電離源2)戴安公司U3000高效液相色譜儀，配有DAD二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱3)EASY-nLC納升液相色譜儀

應(yīng)用范圍：用于小分子有機(jī)化合物的定性分析，可提供精確質(zhì)荷比和同位素豐度，推算分子的原子組成；用于中等極性和強(qiáng)極性大分子物質(zhì)的定性分析，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)等研究。優(yōu)點(diǎn)：高采樣速率、高分辨率、高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量數(shù)MultiplyChargedIonsESIspectrumofHEWLysozyme（溶菌酶）MW=14,305.14大分子樣品會(huì)生成帶多種電荷(from2to20)的樣品離子A亞型MW=18363.5024B亞型MW=18277.4748A亞型+B亞型ESI圖譜可以靈敏地反映蛋白質(zhì)的構(gòu)造NativeAzurinDenaturedAzurin大部分折疊、拼接或復(fù)合的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜是非高斯分布

的，在圖譜上只能觀察到少量的峰，代表較高的m/z值。變性或openform蛋白質(zhì)/多肽較容易離子化，其譜圖是多個(gè)高斯分布的峰。膠和液相雜合分離路線影響ESI因素：樣品的pKa和溶液的pH。樣品在電噴霧溶液中是否已預(yù)先形成離子取決于樣品的pKa值。在低Ph值條件下有利于樣品分子質(zhì)子化，提高pH導(dǎo)致靈敏度和分子所帶電荷的數(shù)目減少。在正離子檢測(cè)中，溶液pH應(yīng)較低，可用醋酸、三氟乙酸(TFA)調(diào)節(jié)。溶液pH通常至少低于樣品的pKa2個(gè)單位。在負(fù)離子檢測(cè)中，溶液pH應(yīng)較高，可用氨水調(diào)節(jié)，使溶液pH比樣品pKa高2個(gè)單位。溶劑的性質(zhì)。溶劑應(yīng)具有較低的汽化點(diǎn)，有較低的黏度和表面張力。常用的ESI溶劑有醇類(lèi)、乙腈、丙酮、水等。常用混合溶劑及添加劑，如甲酸、乙酸、氨及揮發(fā)性緩沖液。去溶劑時(shí)干燥氣體的溫度和流速。應(yīng)保持較高的溫度及流速以利于去溶劑。