《健康人（異體）免疫細(xì)胞CIK的制備和臨床技術(shù)規(guī)程》征求意見稿

2健康人（異體）免疫細(xì)胞（CIK）的制備和應(yīng)用技術(shù)規(guī)程1.適用范圍本文件適用于在有資質(zhì)的醫(yī)師指導(dǎo)下，在正規(guī)的醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)，對腫瘤患者，特別是常規(guī)治療失敗后，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤患者的治療；以及腫瘤患者常規(guī)治療后預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。2.規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。《中華人民共和國藥品管理法》-2019年8月26日修訂國家衛(wèi)健委科教司《體細(xì)胞臨床研究工作指引（試行）》的通知-2023-08-18T/CGCPU019—2022《免疫細(xì)胞產(chǎn)品供者材料管理要求》3.術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1免疫細(xì)胞產(chǎn)品immunecellproduct,經(jīng)過體外分離、培養(yǎng)、擴增后制成的，應(yīng)用于臨床研究的人源活免疫細(xì)胞3.2供者donor,用于免疫細(xì)胞產(chǎn)品（3.1）采集、制備,收獲細(xì)胞的源是健康人.3.3供者材料donormaterials,從符合篩查標(biāo)準(zhǔn)的供者（3.2）獲得的用于免疫細(xì)胞產(chǎn)品（3.1）生產(chǎn)的免疫細(xì)胞。3.4生物安全biosafety,人類生命健康和生態(tài)系統(tǒng)相對處于沒有危險和不受生物因子及相關(guān)因素威脅的狀態(tài).4.細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)資料4.1清洗與消毒4.1.1玻璃器皿的清洗清水浸泡——洗衣粉刷洗——自來水沖洗——晾干，浸酸過夜——自來水沖洗10次以上——蒸餾水洗2-3次——烘干，包裝——滅菌，貯存?zhèn)溆谩?.1.2培養(yǎng)板的清洗3用后立即浸入水中——洗衣粉清洗——自來水沖洗——晾干，浸酸(強酸)過夜——自來水沖洗10次以上——蒸餾水洗2-3次——烘干，浸入70%乙醇（蓋蓋以防乙醇揮發(fā)。臨用前取出，在空氣中干燥，置干凈盒內(nèi)備用。*注不宜用毛刷刷洗，如殘留有附著物，可用脫脂棉蘸水拭掉，流水沖洗干凈。4.1.3載玻片的洗滌新玻片：自來水沖洗——晾干，洗液中浸泡數(shù)小時——流水沖洗數(shù)小時——蒸餾水沖洗數(shù)遍——浸入70%乙醇（蓋蓋以防乙醇揮發(fā)）。臨用前取出，在空氣中干燥，置盒內(nèi)備用。舊玻片：肥皂水煮沸——溫肥皂水洗——流水沖洗——晾干，洗液中浸泡數(shù)小時——流水沖洗——蒸餾水沖洗數(shù)遍——浸入70%乙醇（蓋蓋以防乙醇揮發(fā)）。臨用前取出，在空氣中干燥，置盒內(nèi)備用。*注意不要彼此緊貼在一起4.1.4膠塞的清洗自來水浸泡——2%NaOH煮沸10~20分鐘——自來水沖洗——1%稀HCl浸泡30分鐘——自來水沖洗——蒸餾水沖洗2~3次——晾干，備用。4.2滅菌[原理]使用電熱手提式壓力蒸汽滅菌器，利用在密閉容器內(nèi)加熱，水就能生成壓力蒸汽，蒸汽的溫度隨著壓力的增高而上升，具有良好的穿透性，能使容器內(nèi)的物品迅速潮潤和加熱的原理，使微生物迅速被殺滅，最終達(dá)到滅菌的效果。4.2.1使用前，先檢查主體內(nèi)水位是否超過電熱管。4.2.2在加熱開始時，放氣閥垂直，使空氣隨加熱由桶內(nèi)逸出。待有較急的蒸汽噴出時，即將放氣閥撥回水平位置。4.2.3瓶皿121-126℃15min;器械121-126℃10min;橡膠121℃15min;溶液121-126℃20-40min4.2.4當(dāng)壓力到達(dá)所需的范圍時，開始計算時間。124-126℃滅菌時，安全閥能使之維持恒壓；低于124℃時，則應(yīng)在蒸汽壓力到達(dá)所需范圍時，適當(dāng)調(diào)節(jié)開關(guān)使之維持恒壓。4.2.5滅菌完，要迅速使之干燥者，將滅菌器內(nèi)的蒸汽通過放氣閥迅速排出。等壓力為0時，再稍等1-2分鐘，然后將蓋打開，繼續(xù)加熱10-15分鐘，使物品上殘留的水蒸汽得到蒸發(fā)，隨后關(guān)掉；滅菌液體時，應(yīng)將液體灌裝在玻璃瓶中，以不超過3/4體積為好，瓶口用棉花紗布塞好，并用繩子扎在瓶頸上，使瓶內(nèi)的空氣能自然泄出，而又不致使4瓶塞落入瓶內(nèi)。滅菌完，先關(guān)電源，等壓力為0時，再稍等幾分鐘，打開放氣閥，排出余氣后，才能將蓋開啟。4.3溶液配制4.3.1洗液的配制重鉻酸鉀先溶于水中，然后，將濃硫酸緩慢加入。[強液]重鉻酸鉀63g濃硫酸1000ml蒸餾水200ml「常用」重鉻酸鉀63g溶于800ml蒸餾水,再緩慢加入濃硫酸1000ml.「本室」重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml4.3.2培養(yǎng)液的配制（1）.把干粉加入15-30℃（室溫）三蒸水中，緩慢攪拌令之溶解，并將袋中微量粉末沖下。（2）.加NaHCO32.0g/L1640培養(yǎng)液或3.7g/LDMEM培養(yǎng)液。稀釋至1L。（3）.用1NHCl或1NNaOH將pH調(diào)低于正常pH*7.2—7.3。（在正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.2-7.4間，呈桃紅色。（4）.立即除菌過濾。（通常過濾后pH升高0.1-0.3）4.3.3消化液的配制（0.25%胰蛋白酶）（1）.將pH7.2的PBS液高壓消毒滅菌。(2).稱取胰蛋白酶粉末0.25g，先用少許消毒的鹽溶液調(diào)成糊狀，然后再補足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱內(nèi)過夜，并不時攪拌振蕩。(3).除菌過濾，分裝入瓶，-20℃冰箱保存。4.3.4BSS的配制(PBS克/升）(1).準(zhǔn)確稱量試劑。(含有水份的水化物，與不含水份者的稱量不同，應(yīng)加以換算)。KCl0.2KH2PO40.2NaCl8.0Na2HPO4·7H2O.56.(2).依次溶解在750ml水中，待前一種試劑完全溶解后，再溶解下一種成分。（3）.補足水分至1000ml。除菌過濾或高壓滅菌10min，分裝瓶中，4℃保存。4.4細(xì)胞培養(yǎng)操作技術(shù)4.4.1細(xì)胞計數(shù)法（1）.懸液制備：取待測細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加1ml0.25%胰蛋白酶液，37℃溫箱中消化，至細(xì)胞接近脫離瓶壁前吸出消化液，加新的培養(yǎng)液5.0ml，輕輕吹打制備成細(xì)胞懸液。（2）.染色：取吸管1支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞懸液使細(xì)胞重懸均勻后，立即吸細(xì)胞懸液少許，向離心管中滴入9滴，再滴入0.4%的臺盤藍(lán)染料1滴，混勻，置2-3min。（3）.鏡檢：把計數(shù)板平放在顯微鏡臺上，從邊緣滴1-2滴已染色的細(xì)胞懸液。鏡下觀察可見細(xì)胞5分散各處，健康細(xì)胞胞體完整，透明不著色，凡著色細(xì)胞均為不健康者。（4）.計數(shù)：細(xì)胞數(shù)/ml懸液=（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）*104*毫升數(shù).（5）接種：一般接種量在105-106細(xì)胞/ml范圍.4.4.2細(xì)胞傳代⑴.將瓶中的培養(yǎng)液倒出，鏡檢，離心重懸細(xì)胞，用吸管將瓶壁上的細(xì)胞吹打均勻。⑵.培養(yǎng)中的細(xì)胞分瓶，并加入培養(yǎng)液8-10ml，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑶.懸浮細(xì)胞傳代時，只需吸出少量細(xì)胞轉(zhuǎn)入新瓶，并補足營養(yǎng)液即可。5健康人(異體)CIK細(xì)胞制備規(guī)程5.1儀器設(shè)備條件5.1.1場地條件1）GMP千級凈化室（細(xì)胞制備）100-300m22）普通實驗室（質(zhì)量檢測）50-100m23）洗涮、準(zhǔn)備間2-500m25.1.2大型設(shè)備1）血細(xì)胞分離機（單采機）1臺2）流式細(xì)胞儀1臺,（3）酶標(biāo)分析儀1臺,（4）內(nèi)毒素檢測儀1臺5.1.3普通設(shè)備:（實驗室具備，數(shù)量隨意）5.2供者條件(1)、年齡18-30歲，男、女不限，血型不限?；颊叩挠H屬和朋友更好,(2)、血象WBC在5000/mm3以上，淋巴細(xì)胞20%以上。(3)、無傳染病：甲、乙、丙病原檢測合格、艾滋病毒（HIV）、梅毒陰性。(4)、流式細(xì)胞儀(FCM)測：CD45+細(xì)胞大于2000/mm3,(5)、對K562的自然殺傷活性大于80%。供者的體檢結(jié)果應(yīng)符合國家衛(wèi)生部頒布的《獻(xiàn)血體檢標(biāo)準(zhǔn)》。無菌條件下采集的單核細(xì)胞，收集于CPD抗凝血袋內(nèi)。4℃保存待用，24小時內(nèi)處理。5.3制備程序5.3.1包被培養(yǎng)瓶1）取50ml離心管，分別移入10mlD-PBS。（2）每管加入專用試劑若干，CD3Ab50μl，混勻后移入T75培養(yǎng)瓶，標(biāo)記。(3).將培養(yǎng)瓶平放在4℃冰箱內(nèi)，避光過夜。5.3.2分離培養(yǎng)PBMC:(1).供者條件符合要求。單采機采取分離出相應(yīng)數(shù)量單個核細(xì)胞）。(2)取上述單核細(xì)胞液50ml，平均移入兩個50ml離心管中，加入全血體積20%（每管5ml的羥乙基淀粉，垂直靜置30-60分鐘。（一般降到1/2體積）,(3)將兩管中的上層（血漿+淋巴細(xì)胞）移入新的離心管，350g/10min離心,(4).取上清（血漿）移入新的離心管，56℃水浴/30min滅活,(5)水浴滅活后的血漿，室溫800g/20min離心，取上清（即自體血漿）留6用,(6)取10mlFicoll移入新的50ml離心管,(7)細(xì)胞沉淀用20mlD-PBS重懸，細(xì)胞懸液緩慢加入Ficoll層，室溫，380g/20min離心,(8)吸取PBMC層，加D-PBS至40ml洗滌，室溫，350g/8min離心,(9)棄上清，細(xì)胞沉淀加培養(yǎng)基至40ml洗滌，取樣計數(shù)，室溫，300g/8min離心,(10)計數(shù)細(xì)胞，測定細(xì)胞活度,(11)取包被的培養(yǎng)瓶，棄包被液，用D-PBS和培養(yǎng)基分別洗一次,(12)調(diào)制細(xì)胞懸液，分別加入培養(yǎng)瓶。接種細(xì)胞數(shù)3×107(106/ml)/30ml/瓶,(13)每瓶加入IL-230μl（1000U/μl），IFN-γ15μl(1000U/ml)，自體血漿1.5ml(即血漿濃度為5%)。顯微觀察，置于5%CO2，37℃培養(yǎng),(14)顯微觀察細(xì)胞狀態(tài)，理論上，若第2天細(xì)胞狀態(tài)好，可不加血漿，并且轉(zhuǎn)袋前盡量減少移動細(xì)胞，使細(xì)胞與包被液試劑充分接觸。5.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋，在接種的4天（1）用巴氏吸管吹打貼附在培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，取樣計數(shù)2）吹打后，顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞情況，如仍較多，每培養(yǎng)瓶加入5—10ml培養(yǎng)液繼續(xù)吹打。（此時細(xì)胞一般不用酶來消化，以免損傷細(xì)胞3）計數(shù)細(xì)胞，檢測細(xì)胞活度，殺傷活性，流式細(xì)胞儀測定等4）分離細(xì)胞通過注射器套筒轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋，培養(yǎng)液調(diào)至200ml（1×105/ml），添加IL-2100μl，自體血漿6mlIL-2為500U/ml，補救措施為將血漿含量提高到3%，細(xì)胞濃度一般不可低于0.4×105/ml5）每天顯微觀察細(xì)胞狀態(tài)6）隔天等量添加培養(yǎng)液并取樣計數(shù)細(xì)胞等。同時添加IL-2,500U/ml，自體血漿1%及8萬U/2ml慶大霉素一支所加培養(yǎng)液已加入白蛋白，含量為0.3%，即1000ml培養(yǎng)液加入20%白蛋白15ml）。5.3.4回收細(xì)胞1）在培養(yǎng)袋三次加液后（分離接種細(xì)胞的第12天袋中培養(yǎng)液體積為1200-1800ml(初轉(zhuǎn)袋時150或200ml),收集細(xì)胞2）用50ml離心管分離細(xì)胞，D-PBS洗滌2次，取樣進(jìn)行質(zhì)量檢測。5.4質(zhì)量檢測和標(biāo)準(zhǔn)5.4.1顯微觀察細(xì)胞狀態(tài)，取樣計數(shù)。①肉眼觀察，培養(yǎng)袋或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液清澈，無混濁，②顯微觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，大小基本均勻，反光度好，如有集落形成，證明生長良好。取樣計數(shù)備用。具體方法看第二章：細(xì)胞計數(shù)法。5.4.2細(xì)胞活度：方法為第三章第九節(jié)“臺盼蘭拒染細(xì)胞活度鑒定法”，細(xì)胞活度達(dá)90%以上為合格。5.4.3殺傷活性：效應(yīng)細(xì)胞為CIK細(xì)胞，靶細(xì)胞為K562細(xì)胞。效：靶=20:1,殺傷活性達(dá)80%以上為合格。5.4.4流式細(xì)胞儀檢測CIK細(xì)胞表型：CD3CD56雙陽性細(xì)胞達(dá)20%或以上為合格。具體方法7見：第三章（十一）流式細(xì)胞儀檢測CIK細(xì)胞表型具體方法介紹。安全檢測：熱源，病毒,支原體，細(xì)菌（霉菌）檢測合格。5.4.5（A）熱源檢測-定性檢測法：取CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清液用鱟試劑凝膠法檢測：結(jié)果陰性（-）為合格。定量法測定：原理:熱源又叫內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組成部分。醫(yī)學(xué)工業(yè)普遍接受的觀點---控制內(nèi)毒素污染，就等于控制了熱源（細(xì)菌）污染。鱟試劑內(nèi)含有被微量內(nèi)毒素激活的凝固酶可和鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。據(jù)此可判斷熱源（細(xì)菌）污染與否。5.4.5(B)熱源檢測-定量檢測法：儀器名稱：動態(tài)試管檢測儀ATL/LIK產(chǎn)地：英國(萊伯金耐特)LabKineticsLtd型號：ATi320采購廠商：湛江安度斯生物有限公司光度法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測盒，規(guī)格：10樣本/盒檢測流程：儀器及軟件準(zhǔn)備：試驗前開啟動態(tài)試管檢測儀，溫度在37oC.（1）樣品陽性對照液制備，每個樣品取已制備的樣品溶液0.4ml加入到細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品中，放置漩渦混合器上混合1min,得到樣品陽性對照液2）樣品溶液制備：用配套的采樣瓶采集樣品，每種樣品分別取0.1ml加入到0.9ml樣品稀釋瓶里，混勻，即得樣品溶液,(3).鱟試劑復(fù)溶:開啟鱟試劑和試劑復(fù)溶液，取0.25ml試劑復(fù)溶液加入鱟試劑瓶中，搖勻，放置1min,得鱟試劑溶液，取若干反應(yīng)試管，每管加0.05ml鱟試劑,(4)加樣及反應(yīng)：4.1陰性對照項：取0.1ml樣品稀釋瓶中的溶液加入到0.05ml鱟試劑溶液的反應(yīng)試管，平行兩管，輕輕混勻立即插入動態(tài)試管儀中反應(yīng)。4..2陽性對照項：取0.1ml陽性對照液加入到0.05ml鱟試劑溶液的反應(yīng)試管，平行兩管，輕輕混勻立即插入動態(tài)試管儀中反應(yīng)。4.3樣品檢測項及樣品陽性對照項：每個樣品取0.1ml樣品溶液及樣品陽性對照溶液加入到0.05ml鱟試劑溶液的反應(yīng)試管，各平行兩管，輕輕混勻后立即插入動態(tài)試管儀中反應(yīng)。結(jié)果分析：(1)試驗有效性條件：陰性對照項檢測值應(yīng)小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點的檢測值。(2)試驗準(zhǔn)確性判斷：陽性對照項回收率應(yīng)在50－200%之間。(3)樣品無干擾的判斷：樣品陽性對照項的回收率應(yīng)在50－200%之間。檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)1）細(xì)胞培養(yǎng)液等，細(xì)菌內(nèi)毒素不大于0.5EU/mL，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》;（2）、透析用水中的內(nèi)毒素含量應(yīng)不超過0.25EU/mL，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)YY0572-2015《血液透析及相關(guān)治療用水》3）、透析液，細(xì)菌內(nèi)毒素不大于0.5EU/mL，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)YY0598-2006《血液透析及相關(guān)治療用濃縮物》；依據(jù)：《中國藥典》為強制性標(biāo)準(zhǔn)。85.4.6病毒檢測：HIV、HBV、HCV、TP檢測全部合格---全部陰性：方法按檢測試劑盒說明書進(jìn)行。5.5分裝輸注（1）檢測合格細(xì)胞分裝在150-200ml的生理鹽水中，則細(xì)胞總數(shù)為30-50×108(每瓶細(xì)胞加入慶大霉素4萬U，20%白蛋白5ml，專用試劑20ml)2）輸注前混勻，用輸血器靜脈滴注。程序和輸血一樣。速度60滴/分。（亦可視情而定），（3）輸注每天或隔天一次，6次一療程（細(xì)胞總數(shù)為200-300X108），每年2-3個療程，亦可據(jù)具體情況而定，每療程最好換個供者3）預(yù)防不良反應(yīng)，輸注前三天使用較好：①雷尼替丁0.15gbid,②苯海拉明1片qd,③消炎痛1片qd晚上服，④地塞米松5mg(1支)，輸注前靜脈推注。⑤非那根25mg輸注前肌注，⑥亦可視情況靈活決定。5.6不良反應(yīng)及處理措施，在沒有采取預(yù)防措施的情況下：最常見的不良反應(yīng)是寒戰(zhàn)和發(fā)熱。發(fā)生率5-10%左右。一般在輸注結(jié)束前5-10分鐘或結(jié)束后1-3小時內(nèi)開始，個體差異，反應(yīng)情況不一。第一種情況比較輕微，只有寒戰(zhàn)，自覺有發(fā)冷感5-10分鐘即自行消退，無不適。第二種情況是中等反應(yīng)，先寒戰(zhàn)，后發(fā)熱，發(fā)熱一般在38-39℃之間，可持續(xù)3-5小時，不用處理自行緩解。亦有在39-40℃,若持續(xù)不退，影響入眠，可用常規(guī)退燒針降溫或地塞米松5mg(一支)靜脈推注。第三種情況：又叫異體細(xì)胞反應(yīng)，主要表現(xiàn)在治療后1周皮膚包括面部皮膚騷癢、發(fā)紅，有百針同刺的刺痛感，有牛皮癬樣或硬皮樣改變。三天后有皮膚“干裂”現(xiàn)象，一周后脫皮，脫皮后，皮膚變白，變細(xì)，無后遺癥，有美容之效。此種現(xiàn)象發(fā)生極少，我們10多年來，僅見一例。有關(guān)專家認(rèn)為這種反應(yīng)重，說明異體細(xì)胞對腫瘤攻擊效果更佳。為了安全起見,健康人免疫細(xì)胞治療的患者最好住院治療。6CIK細(xì)胞臨床治療方案和療效評價6.1臨床治療方案6.1.1病例選擇病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實、診斷明確的各種惡性腫瘤。②患者年齡、性別不限。③手術(shù)、放療和化療后病情穩(wěn)定或有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者。病例排除標(biāo)準(zhǔn)1）有嚴(yán)重過敏體質(zhì)的病人。（2）嚴(yán)重心，肝，腎功能衰竭的病人。（3）臨床醫(yī)生認(rèn)為不適應(yīng)的病人。96.1.2治療方案參照2021年2月國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心公布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中的“劑量探索和劑量遞增”原則，每例患者至少二個療程；每療程輸注6次，CIK細(xì)胞總數(shù)為150-300X108個。采用輸血器靜脈輸注細(xì)胞，可考慮采用藥物，如地塞米松5mg，于CIK輸注前靜推，預(yù)防不良反應(yīng)，常規(guī)情況下可不用，有過敏史者，應(yīng)提前預(yù)防。靜脈輸注：每次30-50×108細(xì)胞懸于150-200ml生理鹽水中，每分鐘60滴左右滴注。每天或隔天一次。6次一療程：第一年以2-3個療程，第二年半年重復(fù)一療程，以后每年做一療程，五年后視情況再定。肝動脈灌注：每周一次，每次10-20×108細(xì)胞懸于50-60ml生理鹽水中，3次一療程。不良反應(yīng)及其處理本研究采用的健康人CIK細(xì)胞是異體免疫細(xì)胞，因?qū)＠夹g(shù)處理，治療相當(dāng)安全。有部分病人（3-5%）在細(xì)胞回輸后2-10小時內(nèi)出現(xiàn)體溫升高。中度發(fā)熱（38.50C以下）一般2-6小時內(nèi)可自行緩解。超過390C者可用藥物或物理療法對癥處理。6.2臨床療效評價6.2.1一般臨床癥狀治療前后變化：包括：精神狀況、睡眠情況、體重、食欲、痛疼等（詳見觀察表格）6.2.2實驗室檢查指標(biāo)：癌標(biāo)記物原發(fā)性肝癌治療前后查AFP，CA19-9等非小細(xì)胞肺癌治療前后查CEA和CA125等結(jié)直腸癌治療前后查CEACA724等具體各種癌癥病人治療前后均查AFP、CEA、CA125、CEA。收集資料可綜合分析不同癌標(biāo)記物在不同腫瘤中的臨床意義?；颊咦陨硗庵苎馨图?xì)胞亞群測定治療前、后分別采取病人靜脈全血1ml通過流式細(xì)胞儀（FCM）測定其細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的絕對數(shù)量變化。（見附表）患者自身免疫能力（NK活性）測定治療前、后分別采取病人外靜脈血10ml，檢測患者自身外周血免疫細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性，即NK活性。臨床影像學(xué)指標(biāo)療效評價標(biāo)準(zhǔn)參照1979年WHO確定的實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)擬訂：完全緩解(completeremission，CR)：所有病灶完全消失，至少維持4周；部分緩解(partianremiddion，PR)：雙徑可測病灶，各病灶最大徑乘積之和縮小50％以上，至少維持4周；單徑可測病灶，各病灶最大徑之和減少50至少維持4周。無變化(nochange，NC)：雙徑可測病灶，各病灶最大垂徑乘積之和縮小不足50％以上，或增大不超過25至少維持4周。進(jìn)展(progressivedisease，PD)，一個或多個病灶增大超過25％。包括：CT、B超、PET等，同時參照【實體腫瘤應(yīng)答評估方案】。完全緩解（CR）所有病變完全消失并維持4周以上部分緩解（PR）腫瘤最大橫徑與最大垂直徑的乘積減少50%以上，并維持4周以上好轉(zhuǎn)（MP）腫瘤病灶二徑乘積縮小25%以上，但不足50%，無新病灶出現(xiàn)維持4周以上。穩(wěn)定（SD）腫瘤病灶二徑乘積縮小或增大均<25%，4周無新病灶出現(xiàn)。進(jìn)展（PD）腫瘤病灶乘積增大25%以上，并有新病灶出現(xiàn)。有效率（%）=（CR+PR）例數(shù)/治療總例數(shù)×100%存活時間病人的帶瘤生存和無瘤生存時間應(yīng)是療效評估的重要指標(biāo)。本研究擬采用1、2、3、5年生存時間作為CIK療效評價標(biāo)準(zhǔn)。時間：從病人確診之日計起，至去世之日止。治療組：用CIK生物治療二個療程以上的病例。對照組：和臨床應(yīng)用單位同時期內(nèi)，只用三大常規(guī)療法，不用CIK生物治療的同種病例相比較。7有關(guān)表格CIK細(xì)胞臨床應(yīng)用研究觀察表一患者治療前后一般狀況姓名性別年齡診斷病區(qū)床位病歷號癥狀體征治療前治療后結(jié)論備注精神狀況睡眠情況體重食欲疼痛經(jīng)治醫(yī)生填表人年月日CIK細(xì)胞臨床應(yīng)用研究觀察表二．實驗室檢查及免疫指標(biāo)姓名性別年齡診斷病區(qū)床位病歷號檢測項目AFPCEACA125總T淋巴細(xì)胞Th淋巴細(xì)胞Ts淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞經(jīng)治醫(yī)生填表人年月日CIK細(xì)胞的質(zhì)量和安全檢測結(jié)果1．臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，CIK細(xì)胞的活度是：%。2．MTT法檢測細(xì)胞的活性，CIK細(xì)胞的活性是：%。3．檢查產(chǎn)品細(xì)菌霉菌結(jié)果：第一次菌落第二次菌落。4．血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞的數(shù)目，CIK細(xì)胞的總數(shù)是：()×108。制備者：檢測者：生物治療記錄單（內(nèi)部資料，妥善保管）編號姓名性別年齡診斷細(xì)胞類型第次臍血CIK健康CIK干細(xì)胞其它備注.備注：PBMCNK活性檢測表姓名診斷性別年齡科室住院號科室備注一．制備效靶細(xì)胞時分()抽靜脈血ml，時分得PBMC個（/ml）。取PBMCml（/ml）加稀釋液ml，調(diào)濃度為/ml，共ml取K562ml（/ml）加稀釋液ml，調(diào)濃度為/ml。共ml二．NK活性檢測：1.實驗分組（每組三個平行孔）實驗組：效應(yīng)細(xì)胞μl+靶細(xì)胞靶細(xì)胞組：靶細(xì)胞μl+1640液效細(xì)胞組：效細(xì)胞μl+1640液2.孵育月日時分(μl/孔（E：T=:)μl/孔μl/孔)放入37℃CO2培養(yǎng)箱。3.加MTT月日時分加MTT10μl/孔。4.酸性異丙醇月日時分加酸性異丙醇100μl/孔。5.MK3酶標(biāo)儀（650nm）測OD值。三．結(jié)果：NK活性=靶細(xì)胞組OD值實驗組OD值－效應(yīng)細(xì)胞組OD值）靶細(xì)胞組OD值=檢驗者核對者年月日細(xì)胞質(zhì)量檢測登記表細(xì)胞類型：CIK+DC供者姓名：性別：年齡：資料編號：項目結(jié)果檢驗者核對者正常參考值細(xì)胞活度大于85%殺傷活性80%-88%流式檢測CD3CD56大于20%HIVHBVHCV梅毒霉菌熱源結(jié)論：備注：CIK：X108；DC：X107共ml.主任：年月日7.1生物治療知情同意書（中，英文）生物治療知情同意書患者姓名性別男女年齡歲診斷住院號病區(qū)床號聯(lián)系電話主管醫(yī)師姓名聯(lián)系電話醫(yī)生已向我們解釋了生物治療的有關(guān)事項。我們明白生物治療是一種新的腫瘤治療方法——通過調(diào)節(jié)自體的抗腫瘤免疫能力達(dá)到治療腫瘤的目的。常規(guī)的三大療法本人已接受過，目前這三大療法對本人意義有限，采用腫瘤生物療法是我們的自愿選擇。醫(yī)生告訴我們目前常用的細(xì)胞免疫治療是采用外周血單個核細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞）進(jìn)行體外培養(yǎng)，制備成細(xì)胞量大，殺傷腫瘤活力強的抗腫瘤免疫細(xì)胞，再回輸病人。醫(yī)生還告訴我們，腫瘤生物治療有包括但不限于如下的不良反應(yīng)：單個核細(xì)胞是用單采機分離，需循環(huán)2000-3000ml外周血液，最終收集40-60ml單個核細(xì)胞。在采集過程中，被采者會有頭暈、惡心、手足麻木和采后的一段時間（2-4h）疲勞乏力感覺，有些還會出現(xiàn)枸椽酸中毒，藥物過敏，虛脫等癥狀。醫(yī)生還告訴我們：采出的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，由于種種原因，如化療后細(xì)胞數(shù)量較少，且活性差等，制備CIK細(xì)胞不能成功，失敗可能性有5%左右。我們同意，如果本次不成功，可選擇時機再采血補救。醫(yī)生還告訴我們，CIK細(xì)胞回輸時，會有一些副作用，如寒戰(zhàn)、發(fā)熱等（約有5%），溫度一般不超過38.5℃,而且輸液治療后2-4h會自動緩解。有時還有一過性的疲勞，過度興奮或全身不適等，我們可以理解和接受。醫(yī)生還告訴我們，CIK細(xì)胞免疫治療是一種較新的方法。臨床有效率有50-80%。有些病人療效特別好，甚至可以治愈腫瘤，有些病人可能沒有任何療效。我們完全可以理解和接受。本人知道參與這項治療需支付以下費用：生物治療的成本費，實驗室檢查費，護(hù)理費等。本人已經(jīng)完全理解腫瘤生物治療的上述情況，參與生物治療是自愿的，可以選擇不參加，也知道我可以自由地取消和在任何中止參與，中止參與不妨礙現(xiàn)在和將來的生物治療。本人同意接受生物治療，若違背了治療要求，或由于管理方面的原因，或本人確實存在（發(fā)生）其它不適繼續(xù)參與的事由，醫(yī)生可無需考慮我的意見，隨時中止本人的參與?；颊呋蚣覍伲航?jīng)治醫(yī)師：GUANGZHOUMADICALCOLLEGEAFFILIATEDTUMORHASPITALInformedConsentFormForBiotherapyPatientname:Sex：M/FAge:Diagnosis:No.hospitalized:medicalservice:BedNo.TEL:AttendingPhysician:TEL：Thedoctorhasexplainedtoustherelevantmattersaboutbiotherapy.Weunderstoodthatbiotherapyisanewtreatmentforcancer,whichcanbeachievedbyregulatingthecapacityofautologousanti-tumorimmunity.AtpresentIhavereceivedthreeroutinetreatments,buttheseareoflittlesignificancetome.Mychoiceofusingbiotherapyiscompletelyvoluntary.Thedoctorhasexplainedtousthefollowing：1.Thecellularimmunotherapyisthatusingmononuclearcells(mainlylymphocytes)fromperipheralbloodtocultureinvitro;beingmadeofanti-tumorimmunecells,whichhavealargeamountofpopulationandstrongactivitiestokilltumors;andthentransfusingthembacktothepatientsincommon.2.Mononuclearcellsareseparatedbysinglecollectionmachine,whichrequirescirculating2000-3000mlperipheralblood,andcollect40-60mlmononuclearcellsfinally.Inthecollectionprocess,thedonormayhavethesenseofdizziness,nausea,handsandfeetnumbnessandfatigue2-4hoursafterthecollection,sometimeswillappearintoxicationcitricacid,drugallergies,andanyothersymptoms.3.Thepossibilityoffailureisabout5%whenculturingcellsinvitro，bythereasonsofsmallamountofcellsafterchemotherapy,pooractivity,unsuccessfulwithCIKcellspreparationetc.Weagreewiththat,thistimeifnotsuccess,chooseanothertimeavailableanddrawbloodagaintomakeretrieval.4.TherewillbesomesideeffectswhentransfusingCIKcellstothepatients,suchaschills,fever,etc.(about5%).butgenerallythetemperaturedoesnotexceed38.5℃,andthesideeffectswillrelieveautomatically2-4hafterinfusion.Sometimestherewillappeartransientfatigue,excessiveexcitements,ormalaiseofwholebody,etc，wecanallunderstandandaccept.5.CIKcellsi