免疫共沉淀研究生實驗課

免疫共沉淀

〔co-immunoprecipitation〕1精選ppt背景據(jù)估計，人體中大約總共可產(chǎn)生500,000種蛋白，而單個細(xì)胞可以產(chǎn)生10,000種。在這些蛋白中，80%不是以獨立的方式存在的，而是存在于一個蛋白復(fù)合體中。蛋白-蛋白的相互作用包含在一個細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，我們形象地稱之為通過節(jié)點〔nodes〕連接的樞紐〔hubs〕。蛋白的相互作用2精選pptStandardTechniques Glutathione-S-TransferaseFusionProteins AffinityTags TandemAffinityPurification(TAP)Tags Strep-TagIII QuantitativeProteomics ChemicalCrosslinking Two-hybridYeast Phage-display

UniversalVerificationofInteractionTechniques Co-Immunoprecipitation ConfocalMicroscopy

BiophysicalVerificationofInteractionTechniques FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET) GFP-ProteinProximityImagingMicroscopy(GFP-PRIM) MassSpectroscopy(MS) AtomicForceMicroscopy(AFM) SurfacePlasmonResonance(SPR)3精選ppt實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法，了解免疫共沉淀結(jié)果分析。了解與免疫共沉淀相關(guān)的實驗及進(jìn)展4精選ppt免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為根底的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。金標(biāo)準(zhǔn)用途：測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用伙伴。概念及用途5精選pptbindingwashelutionYYYYY當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保存了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。實驗原理6精選ppt7精選ppt人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于直徑為6cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)大約90%以上融合后，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗3次；參加1mlLysisBuffer〔20mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100,1mMβ-Glycerolphosphate,1mMNa3VO4,Cocktailproteinase，pH7.5〕，冰上放置30min，裂解細(xì)胞；實驗步驟8精選ppt采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑〔NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件不一樣，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑〔0.2％SDS)。為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實驗。Na3VO4作用為保護(hù)磷酸化的蛋白不會被磷酸酶復(fù)原。因此在做磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時需添加。9精選ppt將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃轉(zhuǎn)鼓搖15min，14000g4℃離心15min；吸取上清液到新EP管中，每管加1μg對照兔IgG，同時參加ProteinAagarose，4℃轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)30min，4℃10000g離心5min；preclear及其作用一抗和相應(yīng)來源的normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG中有相同或相似的成分(如無關(guān)IgG),用一抗相應(yīng)來源的IgG與蛋白裂解液和proteinA－agarose可以去除一抗中無關(guān)IgG對蛋白裂解液中物質(zhì)的非特異吸附,二是可以去除蛋白液中與proteinA－agarose非特異結(jié)合的物質(zhì)。做preclear的IgG是不針對特異性抗原的。瓊脂糖珠的選擇SEPHAROSE是注冊商品名,本身是agarose做的凝膠。

10精選ppt轉(zhuǎn)移上清液至一新管中，將每管總蛋白定量至500-2000(250-1000)μg，用lysisBuffer將體積補齊至600-800μl。參加AKT兔抗人多克隆抗體10μl，4℃轉(zhuǎn)鼓過夜(10min)；孵育液體積的控制：考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多那么就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖液太少那么不能溶解抗原，過多那么抗原被稀釋。參加35μlProteinAagarose，4℃轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)2h(10min)；1000g4℃離心5min，PBS洗3次，參加40μl2×SDSSampleBuffer〔125mMTris?ClpH6.8,4%SDS,20%Glycerol,100mMDTT,0.02%溴酚藍(lán)〕沸水浴中煮沸5min；WesternBlot檢測樣品，剩余樣品-20℃保存。11精選ppt抗體的選擇：1.使用明確的抗體：實驗最需要注意的就是抗體的性質(zhì)。抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同，免疫細(xì)胞化學(xué)染色能結(jié)合未必能用在IP反響。仔細(xì)檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題，確保共沉淀的蛋白是由所參加的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于防止污染的發(fā)生；2.使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG3.抗體用量的控制：1-4μg〔通常用2μg〕4.確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。12精選ppt優(yōu)點相互作用的蛋白都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以防止人為的影響；可以別離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。13精選ppt缺點可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；如用westernblot檢驗，必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，假設(shè)預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果〔但如果結(jié)合質(zhì)譜檢測就可以分析所有的結(jié)合蛋白的種類〕。14精選ppt通過質(zhì)譜確定捕獲的蛋白15精選ppt結(jié)果分析鹽離子濃度影響coIP結(jié)果

很多蛋白復(fù)合體對鹽濃度敏感，但敏感性有強弱之別。通常來說，真實存在著的蛋白復(fù)合體能耐受生理鹽〔0.15M〕或更高濃度，即在生理鹽濃度下不會解體。具體如，某種CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高鹽而不解體。因此，了解一個蛋白復(fù)合體對鹽濃度的耐受，既是一個幫助判斷蛋白復(fù)合體是否真實存在的一個重要依據(jù)，更是一個非常重要的生化數(shù)據(jù)；對某些體外生化反響的蛋白原料的純化制備也是很重要的輔助依據(jù)。在生理鹽或更低鹽濃度下進(jìn)行coIP可能增加假陽性幾率—很多蛋白間非特異性的黏粘被記錄下來。通常選擇0.15-0.3M做細(xì)胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進(jìn)行IP。16精選ppt2.過表達(dá)

血清中豐富的BSA可以被任意抗體識別〔其實也是一種相互作用〕，同理高豐度的兩種或多種蛋白人為拼湊到一起，也可以非特異性的黏粘或者發(fā)生弱的相互作用。3.不添加NP40一類外表活性劑，削弱對非特異性結(jié)合的拮抗

NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特異性的蛋白相互作用，提高coIP的特異性。通常IP體系中NP40含量0.2-0.5%。NP40在0.5-1.0%時，染色體很容易析出，造成樣品過粘而需要超聲。17精選ppt4.超聲和凍融的影響很多市售或自制的裂解液過于溫和，需要考慮采用機械或者超聲等手段提高裂解效率〔超聲要慎用，可能破壞弱的相互作用〕。但是，有些時候裂解液的凍融又可能影響某些弱的相互作用，所以不太建議凍融裂解液——即最好裂解液制備好后立即進(jìn)行coIP。如果證實凍融無影響可考慮將蛋白樣品保存-80度待用。5.Tag的影響His-tagged主要用于純化蛋白。用His-tagged蛋白進(jìn)行coIP存在潛在的隱患。因為很多蛋白會有富含histidine的domain，遇到效價非常好的抗體會使很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識別。造成coIP的假象。18精選pptTAPtag不能用于分析鈣調(diào)信號通路。TAPtag實際上從本錢角度和Histag差不多，洗脫試劑價格低廉，因此可用于質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然而由于其中包含鈣調(diào)蛋白和蛋白A的相互作用domain，天然會結(jié)合鈣信號相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然會有天然的干擾，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白〔有相應(yīng)的專利，因此目前無論抗體或交聯(lián)好的beads價格都非常昂貴〕，因此干擾最小、最常用。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分，a-Flag效價比a-HA略高，因此更適合IP。19精選ppttag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比方，分泌蛋白的N端通常有分泌信號肽，如果將tag構(gòu)建到N端，那么外分泌時會被信號肽酶連同信號肽一起切除；所以這時必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時候?qū)ag構(gòu)建在C端會影響蛋白原來的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時候是N端、C端tagged同時分別構(gòu)建，以備萬一。20精選ppt更高效的方法使用Dynabeads?蛋白A或G進(jìn)行免疫沉淀反響Dynabeads磁珠vs瓊脂糖珠別離純化蛋白質(zhì)注重品質(zhì)和特異性，而非數(shù)量。此時，磁珠是最正確的選擇。21精選ppt常見問題及解決策略目的蛋白分子量比預(yù)期大？至少兩種可能性是存在的

一個是在所謂“搖〞的過程中，目的蛋白被修飾。正常的細(xì)胞中有很多departments，每個department都有特定蛋白的存在，比方線粒體蛋白、溶酶體蛋白、葉綠體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白、核蛋白；一旦細(xì)胞被勻漿化，各個departments就不存在了，每個蛋白都會與其他所有蛋白有接觸的時機，所以，發(fā)生一些unexpected修飾〔或切割〕是正常現(xiàn)象。

再有一種可能是B蛋白只能結(jié)合被修飾的A蛋白，從而在免疫沉淀的過程中富集了這種被修飾的A蛋白。22精選ppt2.背景深條帶多，特異性差。最簡單的改進(jìn)方法：換特異性高的抗體，最好用單抗。如果不換抗體，還可以改進(jìn)共沉淀的條件，例如孵育的溫度，孵育的時間，抗體的濃度等等。另外，曝光的時候，時間不要太長，可以降低背景。也可能是抗體濃度過高，可以降低抗體作用濃度。3.沒有檢測到與目的蛋白相互作用的蛋白或者檢測得到的信號太弱裂解液中的去垢劑濃度過高或者配方過于劇烈：降低去垢劑濃度或者更換去垢劑種類〔按作用劇烈程度來區(qū)分:SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS〕受蛋白的亞細(xì)胞定位影響：重新選擇裂解液配方以釋放目的蛋白蛋白之間的相互作用太弱或者不太穩(wěn)定：選擇親和力更高的抗體以捕獲更多的目的蛋白從而捕獲更多的相互作用蛋白;過表達(dá)提高目的蛋白的含量；選擇目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的樣品進(jìn)行免疫共沉淀實驗23精選ppt相關(guān)技術(shù)體外免疫共沉淀〔TnT試劑盒，promega〕免疫沉淀〔immunoprecipitation〕利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原〔常為靶蛋白〕從混合體系沉淀下來。24精選ppt25精選pptPulldown利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將誘餌蛋白與標(biāo)簽結(jié)合，再固化在吸附介質(zhì)上，之后將抗原〔常為靶蛋白〕從混合體系沉淀下來的方法。除了常用的GST-pulldown，還有生物素標(biāo)記蛋白-pulldown，His-pulldown等。26精選ppt27精選pptGlutathione-S-Transferas