課題2-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)-課件2

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)引言：尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。思考1：為何細(xì)菌能將尿素分解成氨？土壤中的細(xì)菌能合成催化分解尿素的脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線(xiàn)菌也能分解尿素。思考3：①怎樣從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌？②怎樣統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌？思考2：土壤中有哪些細(xì)菌能分解尿素？人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。（一）篩選菌株方法：——使用以尿素為唯一N源的選擇培養(yǎng)基篩選。一、基礎(chǔ)知識(shí)：15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4分離分解尿素細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基配方將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000ml。1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目方法：（1）不能區(qū)分死菌與活菌；（2）不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；（3）個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)；缺點(diǎn)：2.間接計(jì)數(shù)法：——稀釋涂布平板統(tǒng)計(jì)。（2）同一稀釋度下，應(yīng)涂布三個(gè)或三個(gè)以上的涂布平板。（1）分離不同微生物要有不同的稀釋度：細(xì)菌一般為104，105，106

。放線(xiàn)菌一般為103，104，105。真菌一般為102，103，104。（3）培養(yǎng)時(shí)，還應(yīng)設(shè)置一個(gè)空白平板和三個(gè)涂布平板一起培養(yǎng)。目的：前者是為了檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染或者滅菌是否徹底；后者是為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。（4）統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)時(shí)：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，并要計(jì)算出某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mＬ)；M代表稀釋倍數(shù)。（5）每克樣品中的菌落數(shù)的計(jì)算公式：——統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)活菌重疊生長(zhǎng)時(shí)，平板上只觀(guān)察到一個(gè)菌落。（6）稀釋涂布平板統(tǒng)計(jì)法的特點(diǎn)：二.實(shí)驗(yàn)操作

1、土壤取樣

選擇肥沃、濕潤(rùn)的土壤，先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。2、制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆應(yīng)采用104，105，106三種不同的稀釋度3、樣品的稀釋◆應(yīng)在火焰旁稱(chēng)取土壤10g。4、取樣涂布◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明稀釋操作不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)?！敉幌♂尪认拢瑧?yīng)涂布三個(gè)或三個(gè)以上的平板。◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。5、微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察（1）培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線(xiàn)菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。（2）在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。并選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：