細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳課件

細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖

凝膠電泳細(xì)胞凋亡（apoptosis）細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過程，凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。生物學(xué)意義：①確保正常發(fā)育生長(zhǎng)：清除多余的細(xì)胞②維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細(xì)胞③積極防御功能：對(duì)病毒感染細(xì)胞阻止復(fù)制細(xì)胞凋亡過程中有一系列特征性的形態(tài)學(xué)等的改變。其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180~200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺細(xì)胞DNA在地塞米松誘導(dǎo)下細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)DNA在核小體連接處斷裂，形成180-200bp或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯狀電泳圖譜(DNAladder)，而壞死細(xì)胞或凋亡后期的繼發(fā)性壞死細(xì)胞DNA電泳后則成模糊的“涂片狀”。材料1.凋亡細(xì)胞：經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞2.提取DNA：基因組DNA抽提試劑盒（RNA酶、蛋白酶K、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、DNAladder標(biāo)準(zhǔn)品等）3.DNA電泳：1%的瓊脂糖凝膠、點(diǎn)樣緩沖液4.實(shí)驗(yàn)器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、臺(tái)式高速離心機(jī)、65℃水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀方法一、胸腺細(xì)胞的制備：小鼠摘眼球并斷椎處死，取胸腺，浸入含5－10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置銅網(wǎng)上研磨，將研磨好的細(xì)胞懸液用尼龍網(wǎng)過濾。2000rpm，離心5min，制成1×107細(xì)胞懸液備用。二、提取胸腺細(xì)胞DNA：⑴裂解細(xì)胞階段（使用到的試劑：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液）將細(xì)胞離心后小心倒出液體，離心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混勻，置于55℃溫浴20分鐘，其間來回顛倒離心管3-5次。(2)結(jié)合DNA階段(使用到的試劑:

結(jié)合緩沖液=B液、3MNaAC,pH4.8)加入10μl3MNaAC，隨后加入1250μlB液，充分振蕩混合均勻（重要?。?，12000rpm離心3min。將上清分2次加入到離心吸附管。靜置1分鐘，12000rpm離心30s，倒掉收集管中廢液。第二次同上，靜置1分鐘，離心30s。(3)漂洗階段（使用試劑：600ul漂洗緩沖液×2=W液）倒掉收集管中的廢液，再加入600ulW液，12000rpm離心30秒。重復(fù)上敘步驟，再次加入600ulW液，12000rpm離心30秒。倒掉廢液，再次12000rpm離心30秒。(4)洗脫收獲（使用試劑：50μl洗脫緩沖液=T液）小心取出離心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，會(huì)使提取DNA變性），將其套入一個(gè)干凈的1.5mleppendorf管中，沿吸附柱的正中間小心加入50μlT液，靜置1分鐘后，于12000rpm離心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因組DNA,取10μl電泳。三、DNA瓊脂糖凝膠電泳：(5)制板:將1%的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取20ml倒板,待凝,取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液至淹沒過膠。(6)加樣：取50uLDNA樣品與10uL點(diǎn)樣緩沖液,混勻,10ul/孔。（DNAmarker直接加樣，5ul/孔）。(7)電泳：點(diǎn)樣孔置負(fù)極，電壓80-100V，電泳至溴酚蘭移出2/3距離時(shí)，關(guān)閉電源。(8)觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見綠色DNA區(qū)帶。注意事項(xiàng)：a步驟2中，加入B液后一定要充分混勻。離心后，小心取出上清，Tips頭不可吸附上白色沉淀（為基因組蛋白）。b漂洗階段（步驟3）一定要離心充分去除漂洗緩沖液，可適當(dāng)將離心時(shí)間延長(zhǎng)。c洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。結(jié)果觀察加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞DNA電泳后呈典型的“階梯狀”條帶。未加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞，DNA無類似改變。細(xì)胞壞死對(duì)照的DNA電泳呈現(xiàn)彌漫的片狀圖譜。地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡1：DNAmarker;2-3：細(xì)胞壞死對(duì)照4-6：細(xì)胞凋亡；7：正常細(xì)胞對(duì)照基因組DNA抽提試劑盒SDS（十二烷基硫酸鈉）：破細(xì)胞膜、核膜，使組織蛋白與DNA分離EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制DNA酶活性，確保目的DNA不再降解Proteinas