新高考生物一輪復習講練課件：第37講　基因工程的基本工具與操作程序（含解析）

第37講基因工程的基本工具與操作程序高考生物一輪復習素養(yǎng)目標一、重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程的概念理解分子遺傳性狀

2.基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)核苷酸序列

磷酸二酯鍵

一種特定的脫氧核苷酸序列

黏性末端

具有專一性①限制酶的識別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個核苷酸組成,少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成;后者是雙鏈序列。②判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是將黏性末端旋轉(zhuǎn)180°,同一種限制酶切割形成的黏性末端應該是完全相同的結(jié)構(gòu)。

不是氫鍵③限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵。④在切割含目的基因的DNA分子時,需用限制酶切割兩次此DNA分子。(2)DNA連接酶

(3)基因進入受體細胞的載體

不僅僅是質(zhì)粒質(zhì)粒

穩(wěn)定保存

限制酶切割位點

3.DNA的粗提取與鑒定(1)實驗原理酒精

NaCl溶液

2mol/L藍色

(2)實驗步驟

研磨

上清液

95%一個方向

2mol/L二苯胺

5min藍色旁欄邊角1.(選擇性必修3,第72頁,“旁欄思考”)DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?2.(選擇性必修3,第74頁,“拓展應用1”)為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子?提示

不是。DNA連接酶連接的是兩個DNA片段,而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。提示

細菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA,是因為細菌在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制,其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別序列,或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到限制酶所識別序列的堿基上,使限制酶不能將其切開。易錯辨析基于對重組DNA技術(shù)的基本工具的理解,判斷下列表述是否正確。(1)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。(

)(2)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因。(

)(3)DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來。(

)(4)E.coliDNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端。(

)(5)當作載體的質(zhì)粒DNA分子上應至少含一個限制酶切割位點。(

)(6)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細胞中,使之穩(wěn)定存在并表達。(

)××××√√二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(1)篩選合適的目的基因①目的基因:在基因工程的設(shè)計和操作中,用于改變

或獲得

等的基因。主要是指

的基因。②篩選目的基因的方法:從相關(guān)的已知

清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。

(2)利用PCR獲取和擴增

①原理:

。

受體細胞性狀

預期表達產(chǎn)物

編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能

目的基因

DNA半保留復制

②條件:參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶(體外用高溫代替)打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物

2種使DNA聚合酶能夠從

緩沖液

引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

維持反應體系pH穩(wěn)定

③過程:PCR過程包括

、復性和

三步

變性

延伸

(3)結(jié)果:DNA分子以

擴增(約為2n,其中n為擴增循環(huán)的次數(shù))。(4)說明①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的

,又可為DNA的合成提供能量。

②引物既可以是DNA單鏈,也可以為RNA單鏈。細胞內(nèi)的DNA進行復制時,也需要引物,一般為RNA片段。③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反應緩沖溶液中一般都要添加Mg2+。指數(shù)形式

原料

(5)PCR技術(shù)和DNA復制的比較

2.基因表達載體的構(gòu)建

基因工程的核心內(nèi)容(1)構(gòu)建基因表達載體的目的①使目的基因在受體細胞中

,并且可以

給下一代。

②使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。

穩(wěn)定存在

遺傳

表達

(2)基因表達載體的組成

(3)基因表達載體的構(gòu)建過程

3.將目的基因?qū)胧荏w細胞

子房

胚囊

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

受精卵

顯微注射技術(shù)

生物類型受體細胞常用方法轉(zhuǎn)化過程微生物原核細胞感受態(tài)細胞法

能夠吸收外界DNACa2+處理細胞↓感受態(tài)細胞↓基因表達載體與感受態(tài)細胞混合↓感受態(tài)細胞吸收DNA分子提醒導入目的基因,可能存在于細胞質(zhì)中,也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中,造成“基因污染”。4.目的基因的檢測與鑒定

目的基因

雜交帶

旁欄邊角1.(選擇性必修3,第79頁,“思考”改編)PCR可以擴增mRNA嗎?利用PCR擴增目的基因時,為什么要用2種不同的引物?提示

不可以,因為PCR是用DNA雙鏈作模板的,不能直接用單鏈RNA作PCR,必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再作PCR。DNA是兩條反向平行的雙鏈,而復制時只能從固定的方向(模板鏈的3'端)開始,所以引物的堿基序列是不同的。2.(選擇性必修3,第80頁,“正文”改編)為什么切割含有目的基因的DNA片段和載體要選用同一種限制酶?是否只能用同一種限制酶?提示

選用同一種限制酶切割會產(chǎn)生相同的黏性末端,可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來。也可以使用能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割。易錯辨析基于對基因工程的基本操作程序的理解,判斷下列表述是否正確。(1)用PCR方法擴增目的基因時必須知道基因的全部序列。(

)(2)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進行復制。(

)(3)將目的基因?qū)腚p子葉植物一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(

)(4)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達。(

)(5)應用DNA探針技術(shù),可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達。(

)××√√×長句應答1.為什么不直接把目的基因?qū)胧荏w細胞,而要用載體?提示

游離的DNA片段進入受體細胞,一般會被直接分解,就算可以進行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì),游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制,導致子代細胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體,由于載體可以在細胞內(nèi)復制,隨著細胞分裂,載體會帶著目的基因存在于每個子代細胞中。這樣,基因工程才有意義。2.新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的檢測原理是什么?提示

新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒是用于快速進行體外定性檢測新型冠狀病毒的醫(yī)療檢測用品,它的工作原理是通過提取病人樣本中的RNA,進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR),通過擴增反應將樣本中微量的病毒信息進行放大,最后以熒光的方式讀取信號。如果PCR之后信號為陽性,那么就可以認為樣本中存在病毒(已經(jīng)感染),反之表明樣本中沒有病毒(未感染)。考點一重組DNA技術(shù)的基本工具新教材新高考(1)教材新增:DNA的粗提取與鑒定(2)教材改動:DNA重組技術(shù)改為重組DNA技術(shù);從基因文庫中獲取目的基因精減為一句話(3)教材刪除:基因文庫的構(gòu)建(1)依據(jù)重組DNA技術(shù)的基本工具,考查基因工程的3種基本工具:限制酶、DNA聚合酶和載體,突出對生命觀念的考查(2)依據(jù)基因工程的要求,結(jié)合限制酶的特點和質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),選擇合適的限制酶,突出對科學探究的考查考向探究考向1結(jié)合基因工程所需工具酶,考查科學實踐中的探究能力1.(2022遼寧撫順一模)某質(zhì)粒分子其中一條鏈的部分核苷酸序列為—CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA—,限制酶EcoRⅠ在單鏈上的識別序列為—GAATTC—。下列敘述正確的是(

)A.一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并在特定位點斷開DNAB.用EcoRⅠ酶切割該質(zhì)粒,至少會產(chǎn)生2個片段C.與其互補片段相比,該單鏈片段中A與T的和所占比例較大D.一個該質(zhì)粒復制n次,得到的雙鏈都是新合成的質(zhì)粒有(2n-1)個答案

A

解析

限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂,A項正確;質(zhì)粒是環(huán)狀的,該質(zhì)粒只有一個EcoRⅠ酶切割位點,用EcoRⅠ酶切割該質(zhì)粒,會產(chǎn)生1個片段,B項錯誤;與其互補片段相比,該單鏈片段中的A和T與互補鏈中的A和T堿基配對,是互補的,它們所占比例一樣,C項錯誤;一個該質(zhì)粒復制n次,含母鏈的質(zhì)粒有2個,其余都是新合成的質(zhì)粒,得到的雙鏈都是新合成的質(zhì)粒有(2n-2)個,D項錯誤?？枷?結(jié)合載體的作用及特點,考查科學思維的能力2.(2022山東蘭山模擬)下圖甲、乙中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點,下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述,錯誤的是(

)A.若通過PCR技術(shù)提取該目的基因應該選用引物甲和引物丙B.構(gòu)建基因表達載體,可選用BamHⅠ剪切C.構(gòu)建基因表達載體時為了防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,可以選用BclⅠ和HindⅢ剪切D.在導入目的基因的受體細胞中,四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因不能同時表達答案

B

解析

PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合,沿相反的方向合成子鏈,故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙,A項正確;構(gòu)建基因表達載體時,應至少保留一個完整的標記基因,便于目的基因的檢測和篩選,圖1中BamHⅠ同時切割兩種標記基因,不能選用BamHⅠ剪切,B項錯誤;圖2中目的基因左側(cè)只能用BclⅠ切割,而質(zhì)粒上沒有目的基因右側(cè)Sau3A的切點,兩者都有HindⅢ的切點,為了防止目的基因與質(zhì)粒自身環(huán)化,應選用BclⅠ和HindⅢ剪切質(zhì)粒和目的基因,C項正確;在構(gòu)建基因表達載體時,使用BclⅠ和HindⅢ

2種限制酶切割質(zhì)粒,氨芐青霉素抗性基因被破壞,不能表達,四環(huán)素抗性基因能表達,D項正確。3.(2022江西模擬)下圖1所示為用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意圖;圖2所示為三種質(zhì)粒示意圖。圖中AP為氨芐青霉素抗性基因,Tc為四環(huán)素抗性基因。EcoRⅠ、PvuⅠ等為限制酶及其切割的位點。復制原點是在基因組上復制起始的一段序列,是指質(zhì)粒在受體細胞中復制時的起點。(1)組成片段D的基本骨架與細胞膜的基本骨架共同含有的元素是

。

(2)圖2中質(zhì)粒A、質(zhì)粒C能否作為目的基因最理想的運載體?

(填“能”或“否”),請說明理由。

。

(3)重組質(zhì)粒成功導入受體細胞的概率一般為10-7,用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒,為了篩選出導入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌,在導入完成后,將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基中的生長狀況不可能的是

,可能性最大的是

。

(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達產(chǎn)物,則需要將重組質(zhì)粒導入山羊的

(細胞)中。

答案

(1)C、H、O、P(2)否質(zhì)粒A缺少標記基因;質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時,復制原點會被限制酶切割,會影響重組質(zhì)粒的自主復制(3)在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長,在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長(4)受精卵解析

(1)脫氧核糖和磷酸交替連接構(gòu)成DNA片段D的基本骨架,脫氧核糖由C、H、O

3種元素組成,組成磷酸的元素是H、P、O;磷脂雙分子層構(gòu)成細胞膜的基本骨架,磷脂分子是由C、H、O、N、P組成;可見,組成片段D的基本骨架與細胞膜的基本骨架共同含有的元素是C、H、O、P。(2)分析圖2可知,質(zhì)粒A缺少標記基因,質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時,復制原點會被限制酶切割,進而影響重組質(zhì)粒的自主復制,所以質(zhì)粒A、質(zhì)粒C均不能作為目的基因最理想的運載體。(3)用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒,當用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割時,Tc(四環(huán)素抗性基因)遭到破壞,而AP(氨芐青霉素抗性基因)結(jié)構(gòu)完好,因此在重組質(zhì)粒導入完成后,將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基中的生長狀況不可能的是在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長,在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長。因重組質(zhì)粒成功導入受體細胞的概率一般為10-7,所以可能性最大的是在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長。(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達產(chǎn)物,則需要將重組質(zhì)粒導入山羊的受精卵中?？枷?DNA的提取和鑒定4.(2022貴州遵義模擬)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖,相關(guān)敘述正確的是(

)A.圖1中溶液a是物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L的NaCl溶液B.圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤,可能導致試管2中藍色變化不明顯C.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶D.圖2中的試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍色答案

B

解析

圖1中的溶液a是研磨液的上清液,A項錯誤;圖2所示實驗的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面,可能導致加熱不充分,試管2中藍色變化不明顯,B項正確;圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精,C項錯誤;圖2中的試管1起對照作用,目的是證明在沸水浴條件下,物質(zhì)的量濃度為2

mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會出現(xiàn)藍色,而DNA遇二苯胺出現(xiàn)藍色,D項錯誤。方法突破1.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較2.圖解限制酶的選擇原則

3.DNA的粗提取與鑒定實驗中的注意事項

考點二基因工程的基本操作程序新教材新高考(1)教材新增:DNA片段的擴增及電泳鑒定(2)教材改動:PCR技術(shù)內(nèi)容更充實;農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法變?yōu)橘Y料卡(3)教材刪除:基因槍法(1)結(jié)合目的基因的選擇與獲取方法,結(jié)合將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的方法,突出對生命觀念的考查(2)依據(jù)PCR技術(shù),掌握擴增目的基因的方法,突出對科學思維的考查(3)依據(jù)基因表達載體的結(jié)構(gòu)和建構(gòu)方法,突出對科學思維和科學探究的考查(4)依據(jù)目的基因的檢測與鑒定的不同方法,突出對科學探究的考查考向探究考向1結(jié)合目的基因的篩選與獲取,考查科學思維能力1.(2022福建上杭一中一模)Kisspeptin(Kp)是脊椎動物的一種肽類激素,對下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)的神經(jīng)元有活化作用。研究者為探究Kp、GnRH以及GnRH受體的相關(guān)基因在下丘腦和垂體中的表達情況,提取下丘腦和垂體中的RNA,采用RT-PCR擴增DNA(RT是反轉(zhuǎn)錄)進行檢測。下列敘述錯誤的是(

)A.RT-PCR過程需要的酶有反轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶B.PCR擴增時能以相關(guān)基因的mRNA的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計引物C.檢測RT-PCR的產(chǎn)物可采用DNA分子雜交和熒光分子雜交技術(shù)D.可檢測到Kp、GnRH、GnRH受體相關(guān)基因均在下丘腦中表達量最高答案

D

解析

RT-PCR是指以RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并對cDNA進行PCR擴增的過程,所以RT-PCR過程需要的酶有反轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶,A項正確;PCR擴增時,引物要與目的基因結(jié)合,根據(jù)堿基互補配對原則,引物也能與目的基因的mRNA結(jié)合,所以能以相關(guān)基因的mRNA的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計引物,B項正確;RT-PCR的產(chǎn)物是DNA,檢測RT-PCR的產(chǎn)物可根據(jù)堿基互補配對原則,采用DNA分子雜交和熒光分子雜交技術(shù),C項正確;根據(jù)題意,Kp和GnRH的受體基因在下丘腦中表達量會比較高,但GnRH受體基因應該是在性腺中的表達較高,因為性腺細胞才是GnRH的靶細胞,D項錯誤?？枷?結(jié)合基因表達載體的構(gòu)建,考查科學實踐能力2.(2022天津南開中學聯(lián)考)右圖為基因表達載體的模式圖,下列有關(guān)基因工程中載體的說法,錯誤的是(

)A.基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建B.基因表達載體的構(gòu)建并不一定相同C.圖中啟動子位于目的基因的首端,是核糖體識別和結(jié)合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作為標記基因,用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因答案

C

解析

由于受體細胞有植物、動物、微生物之分,以及目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同,因此基因表達載體的構(gòu)建也會有所差別,不可能是千篇一律的;啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段,位于目的基因的上游,它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA?？枷?結(jié)合將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的操作,考查科學實踐能力3.(2022適應性考試遼寧卷)菊花是一種雙子葉植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長,還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長。某科研團隊運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關(guān)敘述錯誤的是(

)A.受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞B.將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上構(gòu)建表達載體C.菊花外植體產(chǎn)生的酚類化合物能吸引農(nóng)桿菌移向受體細胞D.應用抗蟲接種實驗,檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度答案

A

解析

據(jù)題意可知,要想獲得轉(zhuǎn)GNA基因菊花,應選擇菊花的體細胞作為受體細胞,A項錯誤;基因工程中構(gòu)建表達載體時,由于T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi),可以將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上,B項正確;菊花外植體產(chǎn)生的酚類化合物能吸引農(nóng)桿菌移向受體細胞,有利于目的基因成功導入,C項正確;已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長,故應用抗蟲接種實驗,檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度,D項正確。考向4結(jié)合目的基因的檢測與鑒定,考查生命觀念4.(2022山西太原模擬)核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA片段)導入動物體細胞內(nèi),通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應答,以達到預防或治療相應疾病的一類新型疫苗。研究表明核酸疫苗不僅具有良好的免疫原性與安全性,且由于核酸更易于修飾與改造,較以往蛋白疫苗具有更大的靈活性和更廣闊的應用前景。請回答下列問題。(1)研發(fā)DNA疫苗時,構(gòu)建含有病原體抗原基因表達載體的過程中需要用到的工具酶有

。

(2)圖中所用的載體是

,構(gòu)建基因表達載體的目的是

,基因表達載體中,驅(qū)動病原體抗原基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)為

。

(3)mRNA疫苗可以由計算機設(shè)計、制造并通過高速機器大批量生產(chǎn)。目前用于制造疫苗的RNA有兩種,非復制型mRNA和自我擴增型mRNA,從圖中可以看出,自我擴增型mRNA的優(yōu)點是可在細胞內(nèi)

。mRNA常被包裹在脂質(zhì)體顆粒中注射到相關(guān)人員的手臂肌肉中,脂質(zhì)體顆粒的作用是

。

(4)病毒核酸檢測試劑盒通常以病毒獨特的基因序列為檢測靶標。PCR擴增時每一個循環(huán)分為

3步,使靶標DNA序列呈指數(shù)增加。每一個擴增出來的DNA序列都與預先加入的一段熒光標記

結(jié)合,產(chǎn)生熒光信號,擴增出來的靶標DNA序列越多,累積的熒光信號就越強。在沒有病毒的樣本中,因為沒有靶標DNA序列擴增,所以就檢測不到熒光信號。

答案

(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)、DNA連接酶(2)質(zhì)粒使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給下一代,同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用啟動子(3)大量復制,提高蛋白質(zhì)合成效率保護mRNA,防止其被酶降解(4)變性、復性、延伸探針解析

(1)構(gòu)建基因表達載體的過程中需要用到的工具酶有限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)、DNA連接酶。(2)圖中所用的質(zhì)?？梢猿洚斶\載體,構(gòu)建基因表達載體可以使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給下一代,同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。基因表達載體中的啟動子可以驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄。(3)從圖中可以看出,自我擴增型mRNA可在細胞內(nèi)大量復制,提高蛋白質(zhì)合成效率。mRNA常被包裹在脂質(zhì)體顆粒中注射到相關(guān)人員的手臂肌肉中,其中的脂質(zhì)體顆粒可以保護mRNA,防止其被酶降解。(4)PCR擴增時每一個循環(huán)分為變性、復性、延伸3步,使靶標DNA序列呈指數(shù)增加。每一個擴增出來的DNA序列都與預先加入的一段熒光標記探針結(jié)合,產(chǎn)生熒光信號,擴增出來的靶標DNA序列越多,累積的熒光信號就越強。方法突破1.目的基因的獲取方法(1)利用PCR獲取和擴增目的基因。(2)人工合成目的基因①反轉(zhuǎn)錄法:主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板,借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈DNA,其過程如下:目的基因的mRNA雙鏈DNA(目的基因)②化學合成法:依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列,推測出其基因序列,然后直接合成目的基因,其過程如下:(3)從基因文庫中獲取目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息,例如,根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——mRNA,以及基因的表達產(chǎn)物——蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。2.啟動子≠起始密碼子,終止子≠終止密碼子(1)啟動子是位于基因首端的一段特殊序列,它是RNA聚合酶識別、結(jié)合的部位。終止子是位于基因尾端的一段特殊序列,作用是使轉(zhuǎn)錄過程停止。(2)起始密碼子和終止密碼子均位于mRNA上,分別控制翻譯過程的啟動和終止。3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導入PCR技術(shù)知識儲備1.PCR技術(shù)的過程2.DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)原理①PCR原理:DNA熱變性原理。②電泳

(2)方法步驟①PCR擴增

使掛在管壁上的液體全部甩下準備?移液?混合?離心?反應②鑒定PCR產(chǎn)物→瓊脂糖凝膠電泳法→配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。(3)使用提示①為避免外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。②該實驗所需材料可以直接從公司購買,緩沖液和酶應分裝成小份,并在-20℃儲存。使用前,將所需試劑從冰箱拿出,放在冰塊上緩慢融化。③在向微量離心管中添加反應組分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換,避免試劑的污染。④在進行操作時,一定要戴好一次性手套。⑤觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。專項突破典例.(2020江蘇)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列,具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例)。請據(jù)圖回答問題。(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種

酶,它通過識別特定的

切割特定位點。

(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成

;PCR循環(huán)中,升溫到90℃是為了獲得

;TaqDNA聚合酶的作用是催化

。

(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物,步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是

(從引物①②③④中選擇,填編號)。

(4)對PCR產(chǎn)物測序,經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列),結(jié)果正確的是

。

A.5'-AACTATGCG----AGCCCTT-3'B.5'-AATTCCATG----CTGAATT-3'C.5'-GCAATGCGT----TCGGGAA-3'D.5'-TTGATACGC----CGAGTAC-3'答案

(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸(3)②④(4)B解析

(1)由圖可知,EcoRⅠ將DNA分子切出兩個黏性末端,可判斷EcoRⅠ是一種限制性內(nèi)切核酸(或限制)酶;限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。(2)DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成磷酸二酯鍵;PCR擴增DNA的過程包括變性、復性和延伸,高溫90

℃變性是為了破壞堿基對之間的氫鍵,獲得DNA單鏈,TaqDNA聚合酶能夠催化以DNA為模板的DNA子鏈沿引物的3'端延伸。(3)引物是一小段單鏈DNA,引物5'端的堿基可以與DNA兩條鏈的3'端的堿基進行堿基互補配對,可作為DNA復制的起始點,子鏈的延伸方向為5'→3'。據(jù)題圖分析,結(jié)合已知序列可知,能與片段F左邊配對的引物為④,與右邊配對的引物為②,故步驟Ⅲ選用的PCR引物應為②④。(4)對PCR產(chǎn)物測序,得到了片段F的完整序列,由于片段F具有被限制酶EcoRⅠ剪切的黏性末端,EcoRⅠ識別的序列是GAATTC,且在G與A之間切割,所以5'端應該是AATTC,3'端是GAATT。解題指引

信息指引(1)已知一小段DNA的序列,采用PCR擴增目的基因(2)已知的DNA序列和PCR引物序列(3)PCR產(chǎn)物測序誤區(qū)點睛(1)EcoRⅠ酶不僅能夠切下目的基因,還能夠切開載體(2)質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子,限制酶切割后得到一個DNA雙鏈(3)一個目的基因的引物有兩種答題要語(1)基因工程的剪刀是限制酶(2)DNA聚合酶催化磷酸二酯鍵形成(3)高溫具有和解旋酶相似的作用,可使氫鍵斷裂核心素養(yǎng)(1)結(jié)合題干信息,分析PCR技術(shù)的過程,形成科學思維習慣(2)掌握PCR技術(shù)的原理和三個基本步驟,學以致用,指導生產(chǎn)生活,培養(yǎng)社會責任專項訓練1.(2022湖北)某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因,實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外,還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產(chǎn)生,以下措施中有效的是(

)A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間

D.提高復性的溫度答案

D

解析

增加模板DNA的量可以提高反應速度,但不能有效減少非特異條帶的產(chǎn)生,A項不符合題意;延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程,但對于延伸中的配對影響不大,故不能有效減少反應非特異條帶的產(chǎn)生,B、C兩項不符合題意;非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復性溫度過低,造成引物與模板的結(jié)合位點增加,故可通過提高復性的溫度來減少反應非特異條帶的產(chǎn)生,D項符合題意。2.(2022湖北開學考試)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量,其原理是:在PCR反應體系中加入引物的同時,加入與某條模板鏈互補的熒光探針,當Taq酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針,使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號,即每擴增一次,就有一個熒光分子生成(如下圖)。下列說法不正確的是(

)A.該技術(shù)的原理是DNA的體外復制,需要用到解旋酶和Taq酶B.該技術(shù)需要用到一對引物,且引物之間的堿基序列不能互補C.該技術(shù)中DNA聚合酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈D.若循環(huán)次數(shù)相同,熒光值越高,證明新冠病毒感染程度越高熒光定量PCR技術(shù)答案

A

解析

PCR技術(shù)用的原理是DNA的體外復制,其中雙鏈解聚靠的是高溫,不需要解旋酶,A項錯誤;PCR技術(shù)用到的引物之間的堿基序列不能互補,以免影響引物與模板鏈的結(jié)合,B項正確;DNA聚合酶只能從引物的3'端開始延伸DNA鏈,C項正確;循環(huán)次數(shù)相同時,熒光值越高,證明感染的新冠病毒越多,感染程度越高,D項正確。3.(2022江蘇連云港模擬)常用的PCR技術(shù)有實時熒光定量PCR、RT-PCR、重疊延伸PCR等,其中重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板,通過多次PCR擴增,從而獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應用前景。利用重疊延伸PCR技術(shù)進行定點突變可以實現(xiàn)對纖維素酶基因的合理改造,