歐李種仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性

歐李種仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性摘要：采用HPLC法測定歐李（PrunushumilisBunge）種仁濃縮液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法測定苦杏仁苷的抗氧化性。結(jié)果表明，提取液中苦杏仁苷的濃度為7.94mg/mL；苦杏仁苷清除DPPH的能力隨著其濃度的降低而下降，當苦杏仁苷溶液濃度為7.50mg/mL時清除率最高，為90.9%。歐李種仁濃縮液經(jīng)氯仿、乙酸乙酯和加熱處理均能提高水相中苦杏仁苷的純度。關(guān)鍵詞：歐李（PrunushumilisBunge）；種仁；苦杏仁苷；高效液相色譜；抗氧化性歐李（PrunushumilisBunge）為薔薇科櫻桃屬落葉小灌木，是我國特有的果實和藥食兼用樹種。其莖葉、果實、根皮具有很高的經(jīng)濟和藥用價值。歐李種仁可以入藥，具有利尿、助消化等功效，能治療消化不良、水腫、腸胃停滯等疾病[1-3]。歐李種仁中含有大量的苦杏仁苷，主要用于治療慢性氣管炎、急慢性呼吸道感染和膿皰病[4]，與其他藥物合用還可治療皮膚癌[5]；苦杏仁苷還具有抗凝血和抗氧化性的作用[6]?？嘈尤受站哂忻鞔_的生理、藥理活性。關(guān)于苦杏仁苷分析檢測的方法也比較完善，但國內(nèi)對歐李苦杏仁苷分離提取工藝的深入研究還較少，所以本試驗采用HPLC法測定歐李種仁濃縮液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法測定苦杏仁苷的抗氧化性，以期為歐李苦杏仁苷提取工藝的改進提供參考。1材料與方法1.1材料試驗于2012年6月在成都大學藥食同源植物資源開發(fā)重點實驗室進行。歐李采自成都大學歐李種植基地。將風干的歐李果實去果肉得到歐李種子，反復淘洗將果肉和種子分開，把得到的歐李種子放入烘箱中50℃干燥24h。干燥后人工去殼得到歐李種仁，將歐李種仁放入烘箱中50℃干燥48h，備用。1.2儀器與試劑DIONEX-HPCL高效液相色譜儀；UV-1800紫外分光光度計。苦杏仁苷標準品（純度大于99.0%，中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇、甲醇和石油醚（成都市科龍化工試劑廠）；DPPH（成都康普泰科技有限公司），以上試劑均為分析純。1.3方法1.3.1標準曲線的制作準確稱取20mg苦杏仁苷標準品置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。采用UV-1800紫外分光光度計多波長掃描檢測苦杏仁苷標準品的最大吸收波長。標準曲線的制作：精確稱取20mg苦杏仁苷標準品置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。準確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于EP管中，分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0mL甲醇，配制成終濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的系列標準品溶液。采用HPLC法測定不同濃度標準溶液，得到相應的峰面積。以系列標準溶液的濃度（C）為橫坐標，色譜峰面積（A）為縱坐標，制作苦杏仁苷標準曲線。色譜條件：色譜柱C18柱；流動相，甲醇-水=30∶70；柱溫28℃；檢測波長220nm；流速1mL/min；進樣量10μL。1.3.2歐李種仁中苦杏仁苷的提取及含量測定取100g干燥種仁粉碎。將粉碎后的歐李種仁粉末置于1000mL的燒瓶中，加入230mL無水乙醇，恒溫水?。?0～90℃）回流1h，抽濾收集濾液，3次重復。向合并濾液中加入少量蒸餾水，利用石油醚萃取去除濾液中的油脂，待分層后取下層液體。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將下層液體加熱濃縮，得到苦杏仁苷濃縮液，利用蒸餾水定容至100mL。分別取1mL上述溶液于2支EP管中，離心處理，取50μL上清液稀釋30倍，0.22μm微孔濾膜過濾，利用HPLC法檢測苦杏仁苷的含量。1.3.3苦杏仁苷抗氧化性測定0.6mmol/LDPPH溶液配制：精確稱取0.039gDPPH，用95%乙醇定容至50mL，稀釋10倍后得到0.6mmol/LDPPH溶液備用。反應體系：1mL待測液加入2mL0.6mmol/LDPPH和2mL95%乙醇，以不加樣品為對照，混勻后于暗處反應30min；另取5mL95%乙醇作調(diào)零對照；在517nm處測定吸光值（A值）。配制7.5mg/mL的苦杏仁苷提取液，進行二倍稀釋得到8個濃度梯度，分別為7.5、3.75、1.875、0.9375、0.4688、0.2344、0.1172、0.0586、0.0293mg/mL。將稀釋后溶液作為抗氧化性測定的待測液，測定其吸光值（A）[7]。1.3.4氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷取苦杏仁苷濃縮液5mL分別置于2個分液漏斗中，分別加入等體積的氯仿和乙酸乙酯，充分振蕩混勻，靜置，待分層后，分別取有機相和水相利用“1.3.2”的方法測定苦杏仁苷的濃度。1.3.5加熱對苦杏仁苷純度的影響將苦杏仁苷濃縮液5mL置于燒杯中，沸水浴中加熱處理10min，之后取樣經(jīng)離心后按照“1.3.2”的方法測定苦杏仁苷的濃度。2結(jié)果與分析2.1苦杏仁苷最大吸收波長的確定如圖1所示，采用UV-1800紫外分光光度計于200～400nm波長下進行多波長掃描，得到苦杏仁苷標準品的最大吸收波長是220nm，故在后續(xù)色譜檢測苦杏仁苷含量時選擇220nm的檢測波長。2.2苦杏仁苷標準曲線根據(jù)標準溶液測得的不同濃度標準品溶液色譜圖（圖2）進行分析，得到各個濃度標準溶液的數(shù)據(jù)，如表1所示。根據(jù)表1中數(shù)據(jù)制作標準曲線，如圖3所示。以苦杏仁苷濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標繪制得到苦杏仁苷標準曲線。該回歸曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9971，可以用于計算苦杏仁苷的濃度。2.3歐李種仁中苦杏仁苷的含量采用HPLC法進行檢測，得到歐李種仁中苦杏仁苷的色譜圖（圖4），其峰面積為731.757mAU·min。根據(jù)標準曲線計算出溶液中苦杏仁苷濃度為7.94mg/mL，即每100g歐李種仁中苦杏仁苷含量為794mg。2.4苦杏仁苷抗氧化性的測定研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化性，能夠還原DPPH[8]。由表2可知，苦杏仁苷清除DPPH的能力隨著苦杏仁苷溶液濃度的降低而下降。苦杏仁苷溶液濃度為7.50mg/mL時，對DPPH的清除率最高，為90.9%；當苦杏仁苷溶液濃度為0.2344mg/mL時，清除率下降為5.4%。2.5氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷分別采用氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷，結(jié)果表明，氯仿和乙酸乙酯均不能將混合液中的苦杏仁苷完全萃取出來；經(jīng)檢測，苦杏仁苷在氯仿相中的含量僅為0.17mg/mL，在乙酸乙酯相中僅為0.21mg/mL，低于萃取之后保留在水相中的苦杏仁苷的含量，表明氯仿和乙酸乙酯不能作為苦杏仁苷的萃取劑使用。但是苦杏仁苷混合液經(jīng)過兩種有機溶劑萃取后，保留在水相中的苦杏仁苷的含量較萃取之前有了較為明顯的提高。這可能是混合液中的部分雜質(zhì)被氯仿和乙酸乙酯分別萃取出去，從而提高了水相中苦杏仁苷的相對含量。2.6加熱對苦杏仁苷純度的影響利用沸水浴加熱可以使醇溶性蛋白發(fā)生變性，從而提高苦杏仁苷的純度。水相提取液經(jīng)沸水浴加熱后，經(jīng)HPLC法測定苦杏仁苷含量色譜圖如圖5所示。溶液中苦杏仁苷濃度為12.1mg/mL，相比較加熱前有了大幅度提高。說明通過加熱處理可以除去苦杏仁苷溶液中的部分雜質(zhì)，從而提高提取液中苦杏仁苷的純度。DPPH法檢測加熱處理后苦杏仁苷的抗氧化活性結(jié)果表明，苦杏仁苷的抗氧化性大幅度地降低（表3）；與檢測不加熱處理苦杏仁苷的抗氧化性比較發(fā)現(xiàn)，在濃度為7.5mg/mL時，加熱后其自由基清除率僅為69.8%；而濃度為1.875mg/mL時的清除率為0。說明經(jīng)過加熱處理后，苦杏仁苷提取液的抗氧化活性有了明顯的下降。3小結(jié)與討論已有研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化作用[6]。本試驗研究結(jié)果表明，苦杏仁苷清除DPPH的能力隨著苦杏仁苷溶液濃度的降低而下降?？嘈尤受杖芤簼舛葹?.50mg/mL時對DPPH的清除率最高，為90.9%。本試驗中提取苦杏仁苷的方法是采用無水乙醇在80～90℃下回流，因為試驗所用材料為植物種子，所以在提取苦杏仁苷的過程中，一些醇溶性蛋白和黃酮類化合物也會被提取出來[9-11]。采用氯仿和乙酸乙酯兩種溶劑對苦杏仁苷的萃取結(jié)果表明，氯仿和乙酸乙酯不能作為苦杏仁苷的萃取劑使用。但是經(jīng)過兩種溶劑萃取后，苦杏仁苷溶液中的部分雜質(zhì)可以被兩種溶劑除去，從而提高了水相中苦杏仁苷的相對含量?？嘈尤受栈旌弦航?jīng)過加熱處理后，苦杏仁苷的相對含量大幅增加，說明加熱處理可以去除苦杏仁苷溶液中的部分雜質(zhì)，從而提高苦杏仁苷的純度；然而苦杏仁苷的抗氧化活性卻大幅下降。經(jīng)檢測，加熱后苦杏仁苷溶液濃度為7.5mg/mL時，自由基清除率僅為69.8%，這可能與加熱去除了部分黃酮或其他抗氧化成分有關(guān)[12，13]。參考文獻：[1]馬建軍，張立彬.野生歐李生長期礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量的變化[J].園藝學報，2004，31（2）：165-168.[2]田金強，蘭彥平，朱克瑞，等.歐李仁綜合利用關(guān)鍵技術(shù)研究[J].中國油脂，2012，37（2）：65-69.[3]林海.歐李仁油抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（15）：105-107.[4]張偉，林彤，江英橋.RRLC法同時測定橘紅痰咳顆粒中苦杏仁苷和柚皮苷[J].中成藥，2012，34（5）：865-868.[5]ZHOUCS，QIANLC，MAHL，etal.Enhancementofamygdalinactivatedwithβ-D-glucosidaseonHepG2cellsproliferationandapoptosis[J].CarbohydratePolymers，2012，90（1）：516-523.[6]WEIY，XIEQQ，ITOY.Preparativeseparationofaxifolin-3-glucoside，hyperosideandamygdalinfromplantextractsbyhighspeedcountercurrentchromatography[J].JournalofLiquidChromatographyandRelatedTechnologies，2009，32（7）：1010-1022.[7]楊虎，張生堂，高國強.玫瑰黃酮的提取及其清除DPPH自由基活性研究[J].食品科學，2012，33（24）：152-155.[8]董捷，尹策，張紅城，等.杏花花粉中苦杏仁苷的抗氧化性研究[J].食品科學，2007，28（8）：65-68.[9]潘進權(quán)，張世英，何敏婷，等.竹葉總黃酮提取工藝及抗氧化特性的研究[J].中國食品學報，2012，12（3）：39-44.[10]張英華，關(guān)雪.刺五加葉中黃酮類提取物的抗氧化性及抑菌作用研究[J].東北