實驗8 植物組織總DNA的提取課件

實驗十一植物組織總DNA的提取掌握用CTAB法提取植物總DNA的方法和基本原理。學習利用紫外分光光度法測定DNA溶液的濃度。一、實驗目的實驗8植物組織總DNA的提取二、實驗原理

通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。

CTAB,SDS等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。實驗8植物組織總DNA的提取再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。實驗8植物組織總DNA的提取

DNA的吸收光譜峰在260nm處，據計算，測定此波長下DNA溶液的OD值，當OD260=1時，雙鏈DNA含量約為50μg/ml，據此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。由于蛋白質的吸收峰在280nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280之值，如該值為1.8-2.0時，認為已達到較高的純度，如低于此值，表明其內含雜質較多，可能影響酶切反應。實驗8植物組織總DNA的提取水稻品種的幼苗葉片三、實驗材料實驗8植物組織總DNA的提取四、實驗器具、藥品試劑水浴鍋，研缽，微量移液器，槍頭，離心管，臺式離心機，液氮，恒溫箱，標簽紙，紫外分光光度計，磁力攪拌機，剪刀等。2%CTAB抽提緩沖溶液，異丙醇,氯仿-異戊醇等實驗8植物組織總DNA的提取

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀DNA溶液實驗8植物組織總DNA的提取五、實驗方法(1)2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱。(2)取少量葉片（約0.2g）置于研缽中，用液氮磨至粉狀；(3)在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時迅即加入700μl的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；(4)將磨碎液分倒入1.5ml的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二；(5)置于65℃的水浴槽或恒溫箱中，每隔10min輕輕搖動，40min后取出；1.DNA的提取

實驗8植物組織總DNA的提取（6）冷卻2min后，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振蕩2~3min，使兩者混合均勻；（7）放入離心機中10000rpm離心10min，與此同時，將600μl的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；（8）用移液器輕輕地吸取上清夜，轉入含有異丙醇的離心管內，將離心管慢慢上下搖動30sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；實驗8植物組織總DNA的提?。?）10000rpm離心1min后，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；（10）60sec后，直立離心管，加入720μl的75%乙醇及80μl5M的醋酸鈉，輕輕轉動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；（11）放置30min，使DNA塊狀物的不純物溶解；（12）10000rpm離心1min后，倒掉液體，再加入800μl75%的乙醇，將DNA再洗30min；實驗8植物組織總DNA的提取（13）10000rpm離心30sec后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數分鐘后，直立離心管，干燥DNA（自然風干或用風筒吹干）；（14）加入50μl0.5×TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37℃恒溫箱約15h，使RNA消解；（15）置于-20℃保存、備用。實驗8植物組織總DNA的提取稱取樣品，液氮研磨，加入預熱的(65℃

)CTAB及β-巰基乙醇

保溫1h,期間不停的搖均吸取上清液,移至新的離心管中,加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕緩顛倒混勻,10000rpm,10min取上清液，移至新的離心管中,加等體積氯仿：異戊醇,顛倒混勻,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的異丙醇（預冷），后4℃/-20℃保溫沉淀10000rpm,10min離心取沉淀，70%乙醇清洗兩次，吹干用TE溶解DNA,然后低溫保存實驗8植物組織總DNA的提?。?）葉片磨得越細越好。（2）移液器的使用。（3）由于植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應迅速，以免組織解凍，導致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。六、注意事項實驗8植物組織總DNA的提取七、作業(yè)(1)本實驗所得的植物總DNA制劑中含有哪些遺傳物質？(2)在DNA抽提過