白地霉fl44菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

白地霉fl44菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

豆腐生產(chǎn)應(yīng)消耗大量的水和排放大量的廢水（主要是黃漿水）。黃漿水中有機(jī)物質(zhì)很豐富,直接排放使水質(zhì)COD、BOD值明顯增加,對環(huán)境造成嚴(yán)重污染,還浪費(fèi)了大量有用的物質(zhì),非?？上?。酸漿是傳統(tǒng)工藝豆腐制作過程中所用的一種蛋白凝固劑,是黃漿水經(jīng)多種微生物混合發(fā)酵的產(chǎn)物,具有特殊的酵香,同時還含有特殊的一些生物活性物質(zhì)。從酸漿中分離篩選出一株高產(chǎn)蛋白的白地霉FL44,是適合利用豆腐黃漿水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的優(yōu)良菌株。如能利用黃漿水通過生物合成蛋白質(zhì),有化害為利,變廢為寶的重大意義。為此我們以豆腐生產(chǎn)廢液(黃漿水)為原料,進(jìn)行了優(yōu)良菌株的選育及工藝條件的探索。1材料和方法1.1材料表面主要原料:黃漿水(購于市場普通豆腐坊);廢糖蜜(購于山東高密糖廠);菌種:白地霉FL44菌株,從酸漿中分離篩選出,實(shí)驗(yàn)室保存。1.2搖瓶種子培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基:葡萄糖2%,用黃漿水配制。搖瓶種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%,用黃漿水配制。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)和現(xiàn)有條件,在黃漿水中添加一定的營養(yǎng)物質(zhì)。1.3設(shè)備和設(shè)備HZQ-Q振蕩器,TDL-5低速臺式大容量離心機(jī),臺面式818型pH測試議,722分光光度計(jì),電熱恒溫干燥箱。1.4方法1.4.1角瓶培養(yǎng)模式將菌種移接到斜面活化培養(yǎng)基上,30℃下活化24h后接1環(huán)于搖瓶種子培養(yǎng)基中,在30℃下振蕩培養(yǎng)約20h,然后按5%接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,在30℃下振蕩培養(yǎng)48h(搖床轉(zhuǎn)速為180rpm)。1.4.2濕菌體的制備發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中,以3500rpm離心15min,自來水水洗兩次,去上清液得濕菌體;將濕菌體于50℃烘干24h,達(dá)恒重,電子天平稱重。1.4.3測定蛋白質(zhì)含量的方法1.4.4測量血糖和ph值的目的2結(jié)果與討論2.1廢糖蜜對蛋白和生物量的影響由于黃漿水培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足菌體的大量生長,所以選擇添加一些比較經(jīng)濟(jì)的營養(yǎng)物質(zhì),以利于菌體的生長。選擇黃漿水培養(yǎng)基外加碳源時,考慮添加0%~8%廢糖蜜,結(jié)果見表1。從表1可知添加廢糖蜜對白地霉FL44生物量和蛋白產(chǎn)量都有明顯的影響。隨著廢糖蜜添加量的增加,生物量和蛋白產(chǎn)量逐漸增加;但當(dāng)廢糖蜜添加量大于6%時,生物量和蛋白產(chǎn)量的增加很小,綜合產(chǎn)量并結(jié)合成本等因素,初步選擇在黃漿水培養(yǎng)基添加6%廢糖蜜。2.2磷酸鹽對黃漿水培養(yǎng)基中fl49生物量和蛋白產(chǎn)量的影響在黃漿水培養(yǎng)基中添加硫酸銨、磷酸氫二銨、碳酸銨和尿素4種不同濃度的不同氮源,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知添加氮源可以明顯提高生物量和蛋白產(chǎn)量,而磷酸氫二銨對白地霉FL44生物量和蛋白產(chǎn)量提高最大,且在添加1%磷酸氫二銨時生物量和蛋白產(chǎn)量均已達(dá)到最高,因此選擇在黃漿水培養(yǎng)基中添加1%的磷酸氫二銨。磷酸鹽濃度對單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)的影響極為顯著,磷酸鹽不足時,糖代謝受抑制,生長緩慢。添加磷源可以明顯提高產(chǎn)量。2.3發(fā)酵溫度對白地霉fl49生物量和蛋白產(chǎn)量的影響發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵結(jié)果的影響分別見表3和表4。從表3可見,發(fā)酵最適溫度以30℃為宜,此時白地霉FL44生物量和蛋白產(chǎn)量均最高。表4顯示,適宜的培養(yǎng)基初始pH值為5~6,可以作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。2.4物量和蛋白產(chǎn)量的影響選擇接種量5%、10%和15%,考查白地霉FL44發(fā)酵時間、生物量和蛋白產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2中可以看出,5%~15%接種量對白地霉FL44的生長時間、生物量和蛋白產(chǎn)量沒有很大影響,因此可以考慮經(jīng)濟(jì)因素,以小于5%接種量作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2.5搖瓶轉(zhuǎn)速對菌體產(chǎn)蛋白的影響因?yàn)榘椎孛故呛醚醢l(fā)酵的菌株,所以發(fā)酵液中溶解氧對白地霉生物量和蛋白產(chǎn)量都有較大的影響。通過改變250mL三角瓶裝液量和搖瓶轉(zhuǎn)速來考察溶解氧對菌體產(chǎn)蛋白的影響。選擇250mL三角瓶裝液量為30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL和搖瓶轉(zhuǎn)速為0rpm、140rpm、180rpm、220rpm、260rpm,進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖3和圖4。從圖3可見,40mL/250mL三角瓶為最佳搖瓶裝液量,圖4顯示,可以選擇最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為220rpm。2.6正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)以上單因素試驗(yàn),選擇對白地霉FL44產(chǎn)蛋白影響較大的不同水平的廢糖蜜、磷酸氫二銨、pH值、接種量,設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34),通過正交實(shí)驗(yàn),確定白地霉FL44生物量和蛋白產(chǎn)量的最優(yōu)條件。實(shí)驗(yàn)選取的因素及水平見表5,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。通過正交試驗(yàn)的優(yōu)化組合,得到白地霉FL44最優(yōu)培養(yǎng)條件是:5%廢糖蜜、1%磷酸氫二銨、初始pH值5.5、4%接種量,與單因素試驗(yàn)比較,降低了廢糖蜜的用量,但達(dá)到了同樣的蛋白產(chǎn)量。2.7白地霉fl49生物量及菌體蛋白含量測定采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化組合的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,定時取樣測定生物量、蛋白產(chǎn)量、含糖量、pH值等,以了解碳源、菌體生長及生理代謝的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出,白地霉FL44生物量在培養(yǎng)8h左右進(jìn)入對數(shù)生長期,30h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,48h生物量達(dá)到最高,之后生物量開始緩慢下降。菌體蛋白含量則在32h~40h達(dá)到最高水平,之后,蛋白含量開始下降,到64h后,菌體蛋白含量穩(wěn)定。生物量的多少直接影響到蛋白的總收率(=菌體生物量×菌體蛋白含量),綜合生物量和蛋白含量考慮,蛋白產(chǎn)量在48h達(dá)到最高,之后,開始下降,至60h穩(wěn)定,因此,確定最適培養(yǎng)時間為48h。3蛋白和總糖含量測定通過實(shí)驗(yàn)研究初步確定白地霉FL44利用黃漿水產(chǎn)蛋白的搖瓶培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為:5%廢糖蜜、1%磷酸氫二銨、初始pH值5.5、4%接種量,裝瓶量40mL/250mL三角燒瓶、搖瓶轉(zhuǎn)速220rpm、30