反相高效液相色譜法測定大黃、大黃浸膏、清胃顆粒劑中成分

反相高效液相色譜法測定大黃、大黃浸膏、清胃顆粒劑中成分

清胃粒劑是一種新型的三種中藥制劑，包括單味中藥大黃。具有清胃、除惡解毒、收縮止血的功效。它對食欲不振、腫脹和惡心也很有效。大黃的化學成分復(fù)雜,其中蒽醌類化合物是重要的活性成分之一。劉玉琦等、王友京等和錢耀賢等已分別從實驗性胃潰瘍病理形態(tài)學特征、腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化及大黃醇提片臨床藥理學研究中推測,游離蒽醌是可能起主要作用的有效成分;茍奎斌等通過體外試驗進一步證實,大黃游離蒽醌對幽門螺桿菌具有較強的抑制活力。為了有效地控制大黃清胃顆粒劑產(chǎn)品質(zhì)量,保證臨床用藥合理有效,本文建立了適合大黃藥材、大黃浸膏和清胃顆粒劑中游離蒽醌蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚同時測定的反相高效液相色譜(RP—HPLC)定量分析方法,為大黃清胃顆粒劑生產(chǎn)過程質(zhì)量控制提供有效的檢測手段。1藥物、藥品和清胃顆粒高效液相色譜儀:Waters510高壓輸液泵、Waters486可變波長紫外檢測器、島津CR—6A色譜數(shù)據(jù)處量機。蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、大黃素(Emodin)、大黃酸(Rhein)、大黃酚(Chrysophanol)和大黃素甲醚(Physcion)標準對照品購自中國藥品生物制品檢定所,經(jīng)RP—HPLC分離鑒定均為單一色譜峰。大黃藥材購自甘肅禮縣,經(jīng)中國藥科大學生藥教研室鑒定為正品掌葉大黃(RheumpalmatumL.)。大黃浸膏及清胃顆粒劑由南京空軍醫(yī)院制劑室提供,其中清胃顆粒劑規(guī)格為每包12g,含生藥6g。實驗所用試劑甲醇、高氯酸、乙醇、無水乙醚等均為國產(chǎn)分析純,水為二次蒸餾水。2方法和結(jié)果2.1柱溫2.2%vfm檢測波長7.色譜柱:YWG—ODS10μm(200×4.0mmID)不銹鋼柱,流動相:甲醇—水—高氯酸(75∶25∶0.1V/V),檢測波長254nm,靈敏度0.02aufs,流速1.0ml/min,柱溫控制20℃,進樣量20μl。圖1為大黃清胃顆粒劑樣品RP—HPLC分離典型譜圖,其中蘆薈大黃素tR6.23min、大黃素tR9.65min、大黃素tR16.50min、大黃酚tR25.41min、大黃素甲醚tR45.03min。2.2提取混合標準溶液精密稱取游離蒽醌蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚標準對照品各約20.0mg,分別置于五個25ml棕色量瓶中,加入甲醇超聲溶解,定容制成標準貯備液。依次精密吸取上述標準貯備液各4.0ml置于另一25ml棕色量瓶中,加入甲醇至刻度,混勻制成混合標樣?；旌蠘藰油ㄟ^甲醇稀釋配制成含游離蒽醌蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚各約2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0μg/ml的混合標準溶液系列。精密吸取混合標準溶液20μl進樣分析,以游離蒽醌各組分的色譜峰面積(A)對相應(yīng)的標準溶液濃度(C)進行線性回歸,計算回歸方程,即蘆薈大黃素A1=3.654×104C+1628,r=0.9992(n=5);大黃酸A2=3.072×104C+2413,r=0.9997(n=5);大黃素A3=3.316×104C-802.7,r=2.134×104+695.6,r=0.9992(n=5)。2.3天麻清胃顆粒劑萃取大黃藥材干燥切片,粉碎并過60目篩,在60℃下烘3h后取出,置干燥器中儲存?zhèn)溆谩＞芊Q取大黃藥材6g,加70%乙醇60ml浸漬14h后加熱回流80min,過濾提取液,制得相應(yīng)的大黃藥材樣品液。精密稱取大黃浸膏2.4g(相當于大黃生藥6g),加70%乙醇60ml超聲溶解,過濾,制得相應(yīng)的大黃浸膏樣品液。取不同批號的大黃清胃顆粒劑試生產(chǎn)樣品各5包,混合后研細。精密稱取12g,加70%乙醇60ml加熱回流30min,過濾提取液,制得相應(yīng)的大黃清胃顆粒劑樣品液。精密吸取各待測樣品液1.0ml,水浴60~70℃減壓揮干溶劑后,加二次蒸餾水5.0ml渦旋振搖溶解,3500rpm離心5min。精密吸取上清液1.0ml置于分液漏斗中,加無水乙醚10ml一次萃取(振搖3min,放置5min)。乙醚萃取液氮氣流下?lián)]干,殘留物用RP—HPLC流動相溶解,3500rpm離心5min后取上清液20μl進樣分析,由標準曲線回歸方程計算大黃藥材、大黃浸膏及清胃顆粒劑樣品液中游離蒽醌各組分的含量,結(jié)果見表1。2.4加樣回收率試驗精密稱取已知含量的大黃清胃顆粒劑細粉12g,準確加入一定量五種游離蒽醌混合標準溶液,按“樣品定量分析”項下方法操作,計算大黃清胃顆粒劑中游離蒽醌的加樣回收率,具體結(jié)果列于表2,其中蘆薈大黃素為95.61%(n=5),RSD3.05%;大黃素為98.03%(n=5),RSD2.77%;大黃酸為100.1%(n=5),RSD2.21%;大黃酚97.49%(n=5),RSD3.64%;大黃素甲醚為96.79%,RSD4.12%。2.5天麻清胃份液中游離,黃素的表達,是穩(wěn)定性分精密吸取濃度為32.0μg/ml的五種游離蒽醌混合標準溶液20μl,重復(fù)進樣5次,結(jié)果求得蘆薈大黃素保留時間RSD1.12%,峰面積RSD1.98%;大黃素保留時間RSD1.25%,峰面積RSD2.03%;大黃酸保留時間RSD1.06%,峰面積RSD2.18%;大黃酚保留時間RSD1.48%,峰面積RSD2.25%;大黃素甲醚保留時間RSD2.08%,峰面積RSD2.58%。精密稱取同一批大黃清胃顆粒劑細粉12g共5份,按“樣品定量分析”項下步驟平行制備待測樣品濃集液,RP—HPLC連續(xù)進樣分離分析其中五種游離蒽醌的含量,結(jié)果大黃清胃顆粒劑中游離蒽醌蘆薈大黃素濃度RSD2.85%;大黃素濃度RSD2.61%;大黃酸濃度RSD2.38%;大黃酚濃度RSD3.17%;大黃素甲醚濃度RSD3.68%。3中藥制劑質(zhì)量控制RP—HPLC已成為大黃及其中成藥制劑中蒽醌成分含量測定的常用方法。本文選擇國產(chǎn)YWG—ODS10μm(200×4.0mmID)色譜柱,以甲醇—水—高氯酸(75∶25∶0.1V/V)為流動相,254nm通用波長檢測,實現(xiàn)了大黃清胃顆粒劑中五種游離蒽醌成分的基線分離?？赡苁菄a(chǎn)填料與進口填料色譜性能的差異,使大黃素甲醚的保留時間相對較大。但實驗結(jié)果表明,本文建立的定性定量大黃藥材、大黃浸膏及清胃顆粒劑中五種游離蒽醌成分的RP—HPLC方法,實用方便、定量準確、檢測靈敏,適用于大黃清顆粒劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。作為一味具有瀉下作用的中藥材,大黃及其中成藥中蒽醌成分的檢測結(jié)果多為總蒽醌含量,故樣品制備一般采用酸水解處理。而大黃清胃顆粒劑的質(zhì)量控制,由于其藥理活性成分已多方證實為游離蒽醌成分,且大鼠幽門結(jié)扎型胃潰瘍模型的實驗結(jié)果進一步反映了其臨床治療價值,因此本文對于大黃清胃顆粒劑包括其生產(chǎn)原料大黃藥材及過程產(chǎn)品大黃浸膏的定量分析均延用大黃清胃顆粒劑活性成分提取工藝來操作,RP—HPLC直接測定其中五種游離蒽醌成分的含量來表征產(chǎn)品的真實質(zhì)量。同時,為了避免大黃清胃顆粒劑提取液共存雜質(zhì)的干擾,選用無水乙醚一次萃取以純化分析樣品,使RP—HPLC分離基線平直,分離結(jié)果良好。中藥制劑的質(zhì)量控制涉及到中藥材品質(zhì)優(yōu)劣及其生產(chǎn)的全過程。清胃顆粒劑選用優(yōu)