甘薯淀粉測定方法標(biāo)準(zhǔn)化研究進(jìn)展

甘薯淀粉測定方法標(biāo)準(zhǔn)化研究進(jìn)展

淀粉是植物相互作用的主要產(chǎn)物。它不僅是人類和其他生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，也是工作效率不可或缺的原料。淀粉的測定方法很多,如何選用和評價合適的測定方法,如何提高不同測定方法所測結(jié)果間的可比性便成為眾所關(guān)心的問題。甘薯是一種重要的淀粉作物。選育高產(chǎn)、高淀粉甘薯新品種是我國甘薯育種最主要的目標(biāo)之一。高效地測定和評價淀粉含量是甘薯育種上的一個重要環(huán)節(jié)。由于不同測定方法在測定速度、操作簡便程度、準(zhǔn)確度和精確度、儀器依賴程度等方面存在一定差異,這不僅會影響測值間的可比性,而且最終會影響品種篩選的可靠性及其篩選效率。本文在總結(jié)和評價現(xiàn)有淀粉測定方法的基礎(chǔ)上,對甘薯淀粉測定方法標(biāo)準(zhǔn)化所面臨的問題及今后研究發(fā)展方向進(jìn)行了探討和分析,為及早提出甘薯淀粉測定標(biāo)準(zhǔn)化方法提供依據(jù)。1測定甘薯粉的取樣方法正確取樣是保證甘薯淀粉測值準(zhǔn)確的重要環(huán)節(jié)。為確保取樣具有代表性,必須要有正確的取樣方法和合適的取樣量。1.1田間取樣主要關(guān)注小區(qū)內(nèi)植株群體在田間試驗中,通常設(shè)小區(qū)來比較品種間或相同品種不同處理間的差異,因此,田間取樣主要針對小區(qū)內(nèi)植株群體取樣。要求所取樣品能準(zhǔn)確反映整個小區(qū)植株群體的特點。1.1.1淀粉積累的測定取樣時期取決于測定淀粉的目的。當(dāng)作為評定品種依據(jù)時,大多文獻(xiàn)認(rèn)為應(yīng)在扦插后約4個月以后,即淀粉積累達(dá)到最高峰時測定,以便科學(xué)地反映出品種本身特性。1.1.2采樣方法取樣方式直接影響取樣代表性。通常隨機(jī)選取或間隔幾株選取3株以上植株,再從每一株上隨機(jī)選取中等薯塊組成大田樣品。1.1.3第1335.1.4.135取樣量對取樣代表性有影響。適當(dāng)增加取樣量可提高代表性,但受人力等條件限制,實際上不可能多取,這就需要確定一個最適或最低取樣量。從文獻(xiàn)資料上看,每區(qū)對植株取樣,一般隨機(jī)選擇3株以上;對薯塊取樣,一般隨機(jī)選擇中等薯塊3個以上。1.1.4樣品的體積如異地取樣,還需解決所取樣品的包裝和貯運問題。Bradbury等(1988)認(rèn)為,應(yīng)把貯運造成的重量損失考慮在內(nèi)。1.2室內(nèi)取樣室內(nèi)取樣是針對同品種或處理的薯塊群體,要求所取樣品能準(zhǔn)確反映整個薯塊群體。1.2.1時間對鮮薯的影響室內(nèi)取鮮樣應(yīng)及早開始,越早越有代表性。如延誤時間,則鮮薯的理化特性均會發(fā)生變化。Fonseca等(1994)認(rèn)為,鮮薯的淀粉和干率應(yīng)在收獲后24h內(nèi)測完。1.2.2去薯皮的取樣如樣品量少,全部取用,但如樣品量大則有一個取樣方式或樣品壓縮方式問題。薯塊取樣方式主要包括是否去皮、切樣方式、取樣部位和樣品狀態(tài)等。所取樣品是否要去薯皮取決于實驗具體要求。一般樣品不應(yīng)去皮。具體取樣方式現(xiàn)已報道的有5種:1)鮮薯橫切,頭、中和尾部各取一塊,組成混合樣品;2)鮮薯縱切成1或2次,對角取樣,組成混合樣品;3)鮮薯縱切二刀后再中部橫切,對角取樣,組成混合樣品;4)鮮薯橫切數(shù)塊,去頭尾,取中部1/3作為壓縮樣品;5)鮮薯縱切成2～3mm厚數(shù)片,間隔取3片組成壓縮樣品。至于不同取樣方法對甘薯淀粉含量測值是否有影響現(xiàn)尚無報道,有待進(jìn)行研究。1.2.3采樣數(shù)量所有文獻(xiàn)都采用二等分法或四等分法來獲得適量樣品。2測定甘薯粉的制備方法預(yù)處理法2.1鮮薯的預(yù)處理從已有文獻(xiàn)資料來看,無論是直接用鮮薯測定甘薯淀粉,還是制成干樣,對鮮薯均要進(jìn)行如下處理:鮮薯先用水沖洗干凈,用吸水紙吸干或直接涼干,再采用適當(dāng)方法取適量樣品作進(jìn)一步處理。2.2樣品的干樣品制備2.2.1不同的制樣方法將鮮薯樣品制成薯干樣,一是為了防止鮮樣的水分和品質(zhì)發(fā)生變化,二是為了便于其他成分的分析。這里,樣品干燥主要是指為測定淀粉而進(jìn)行的干燥。它涉及干燥溫度、時間和設(shè)備和樣品狀態(tài)等幾個方面。從許多的文獻(xiàn)報道來看,制樣大多采用恒溫鼓風(fēng)干燥方法,但所采用的樣品狀態(tài)不同,有絲狀、條狀、片狀、漿狀和丁粒狀等多種,但以片狀為多;所取樣品量不同,有10g、20g、25g、100g、300g、400g、500g和1000g等,但大多取100g;所采用溫度不同,有40℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃和105℃等,但大多選用70℃;干燥時間從5h到4天不等,大多24h,以烘至恒重為準(zhǔn)。此外,也有文獻(xiàn)報道采用變溫法,如先用50～60℃烘0.5h,再用100～105℃烘干;先用65℃烘24h,再用95℃烘干;先曬干,再60℃烘至恒重;先80℃烘8h,再105℃烘干;先85～90℃烘1h,再70℃烘干;先60℃烘56h,再100℃烘7h等等。由此可見,迄今,有關(guān)甘薯制樣還沒有一個統(tǒng)一的方法,至于不同的制樣方法對甘薯淀粉含量測值是否有影響更未曾有人進(jìn)行過比較研究。因此,為提高不同方法測定結(jié)果間的可比性,有必要制定一套統(tǒng)一的,有可比性的干燥方法和步驟。2.2.2粉碎方法的影響以往研究表明,樣品顆粒大小會影響測定結(jié)果。顆粒大,溶劑接觸面積小,并增加溶劑在顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散時間,延緩糖等物質(zhì)溶解,最終影響提取效果。但樣品顆粒也不是越小越好,顆粒太小,不僅增加粉碎難度和成本,而且還會因樣品太細(xì),造成結(jié)團(tuán),反而不利于提取。并且制備過細(xì)樣品,有時也會因粉碎造成的高溫引起化學(xué)成分的變化。因此,樣品顆粒應(yīng)有一個合適的粉碎度。目前文獻(xiàn)報道所采用的粉碎細(xì)度有20目、40目、80目、60目和200目等,但以40目較多。至于樣品細(xì)度應(yīng)以多少目最為適宜,也未曾有人進(jìn)行過研究。3對于淀粉含量的測定,適當(dāng)把鮮薯作為鮮薯或甘薯淀粉可以是鮮薯塊根直接分析,也可以制成薯粉間接分析。但陸國權(quán)等(1996)發(fā)現(xiàn)由于淀粉酶的作用,樣品干燥前后的淀粉含量會發(fā)生變化,相同品種的塊根,用鮮薯測出的淀粉含量和用其薯干測出的淀粉含量,即使都換算成干基,仍存在著一定的差異。因此,建議涉及淀粉含量時說明是用鮮薯測得,還是用薯干測得,并換算成干基表示。但無論是用鮮薯測定,還是用薯干測定,其淀粉測定方法都是一樣的。目前,甘薯淀粉含量的測定常用物理法、化學(xué)法和色譜法等方法。3.1物理方法一般物理方法速度快,操作簡便,不需化學(xué)試劑和貴重儀器,成本低,但準(zhǔn)確性較差。為此需增加重復(fù)次數(shù),現(xiàn)大多要求有3～4次重復(fù)。3.1.1細(xì)胞間孔隙度稱出鮮薯塊放入水之前和在水中的重量,計算出比重,查表得淀粉含量。李洪民等(1989)研究得到淀粉率(%)=97.30×比重-87.57,r=0.639**。由于細(xì)胞間孔隙度因品種間差異較大而造成淀粉測值誤差較大,因此,難以廣泛應(yīng)用。但作鑒定初級育種材料,仍不失為一種快捷方法,且測定后的薯塊仍可留種。3.1.2干率與淀粉率的關(guān)系根據(jù)甘薯干率與淀粉含量成正比關(guān)系,通過建立干率—淀粉率相關(guān)關(guān)系算得。淀粉率(%)=干率(%)×0.86945-6.34507,干率與淀粉率間相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.9以上。干率換算法簡便易行,速度快,準(zhǔn)確性較好,是目前使用最廣的方法之一,可適用于大批育種初級材料的速測。但其換算值往往比生化法高,其公式中的常數(shù)還有待進(jìn)一步校正。3.1.3加漿法稱優(yōu)法SakamotoS等(1985)提出一種小規(guī)模測定淀粉方法:取2kg鮮薯,清洗,切片機(jī)切片,混合均勻,從中隨機(jī)取100g混合樣品兩份,加250ml水,用打漿機(jī)打漿,10000r/min,1.5min,漿水過200目,并加6L水?dāng)嚢枨逑?靜止過夜后棄去上清液,曬干后,再在80℃烘箱鼓風(fēng)烘8h,105℃下再烘6h,稱重測得。賀觀欽(1995)認(rèn)為本法易于掌握,成本低,不需專門熟練操作人員,適于測定條件較差的地方。但因其分析周期長,淀粉提取往往不徹底,淀粉測值偏低,不適于大批樣品的準(zhǔn)確測定,一般適于測定育種中級材料的淀粉含量。3.1.4irs法測甘薯淀粉含量的方法陸國權(quán)等(1990);李良等(1992);WuYP等(1995)都先后成功地應(yīng)用NIRS法測定甘薯淀粉含量。本法系測定淀粉含量最新速測方法,具有許多方法難以比擬的優(yōu)點,準(zhǔn)確性好,重現(xiàn)性好,操作簡單,無需試劑,是迄今最理想的快速、準(zhǔn)確和實用分析方法。但因儀器價格較高,一時難以推廣普及。今后隨著該儀器的國產(chǎn)化,其價格必然下降,因此,該法具有很大應(yīng)用潛力。3.1.5定儀工藝系統(tǒng)據(jù)賀觀欽(1995)報道,65SC-150型甘薯淀粉測定儀可一次性完成切碎、磨漿、過濾、脫水和濕淀粉的提取全部工藝過程。樣品用量僅100～500g,需時8～12min,但其測值比化學(xué)法低2%～3%,擬用于甘薯初、中級材料淀粉的測定。3.1.6馬鈴薯糖酸鈉er折光儀是一種小巧玲瓏,攜帶方便的微型儀器,專用于測定溶液的含糖量或固形物。具有快速簡便、準(zhǔn)確實用等特點,是迄今最簡單方便的糖分測定方法。Walter(1992)根據(jù)薯汁折光率與薯塊含糖量間存在相關(guān)性,通過建立測定方程,先用折光儀間接預(yù)測塊根含糖量,并建立了預(yù)測方程:含糖量%=(RI-4.077)/1.155×100。薯汁折光率(RI)與HPLC所測含糖量間的相關(guān)達(dá)r=0.897。由于折光儀測值也直接反應(yīng)薯汁固形物含量,而薯汁固形物含量與薯塊干物質(zhì)含量或淀粉含量存在相關(guān)性,因此,是否可通過建立薯汁折光率與塊根淀粉含量間的相關(guān)方程來預(yù)測塊根淀粉含量是一個值得研究的新課題。3.2葡萄糖還原性測定方法淀粉的化學(xué)測定法是最常用的方法。其測定原理是根據(jù)淀粉是一種葡萄糖的聚合物,其最終水解產(chǎn)物為葡萄糖,而葡萄糖具有還原性,可用氧化還原法測定,從而計算出淀粉含量。具體測定方法有:容量分析法、比色分析法、旋光分析法、極譜分析法等。但不管那種化學(xué)法,其供測樣品都需先進(jìn)行處理,包括淀粉提取、淀粉水解和還原糖測定等。3.2.1糖液的提取方法甘薯淀粉的提取在某種意義上是樣品脫糖。其方法與可溶性糖的提取方法相同。一般提取糖類須先將細(xì)碎樣品加石油醚提取,除去脂類和色素等物質(zhì)。再加提取劑提取,但由于甘薯含脂量極少,所以,往往將此操作省去。(1)加鹽水預(yù)處理鑒于糖能溶解于水中,因此可用水脫糖,溫度約40～50℃。如張大鵬等(1993)采用200g鮮薯加500ml水勻漿、過篩,加水洗3次,45℃鼓風(fēng)干燥,供測淀粉。林汝湘等(1995)用25g在5℃下水提糖,殘渣供測淀粉。但由于一定溫度的水可溶解可溶性淀粉和糊精以及蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖和色素等其他干擾物質(zhì),因此,本法系統(tǒng)誤差往往較大。一般很少應(yīng)用,如使用,一般也要控制好提取溫度,不要太高,以減少淀粉的損失和雜質(zhì)的干擾。(2)酒精脫糖提取酒精水溶液是常用脫糖溶劑,糖類在乙醇水溶液中具有一定的溶解度。當(dāng)提取液中的酒精濃度在70%～75%(v/v)以上時,蛋白質(zhì)及大多數(shù)多糖都不能溶解,且可避免糖類的酶解。所以,酒精脫糖是最為常用的提取方法。據(jù)文獻(xiàn)報道,酒精水溶液中的酒精濃度有70%、80%、82%、85%和95%幾種,但大多用80%,有文獻(xiàn)還指出如樣品含水多,則應(yīng)將混合液的最終濃度調(diào)整到75%～85%的范圍內(nèi)。可見關(guān)于酒精濃度已有一個相對公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn),即以酒精濃度80%最宜。文獻(xiàn)報道的提取溫度和時間有40℃提12h,50℃提30min,60℃提6h,70℃提30min,80℃提15min和煮沸提取10～20min等等,提取次數(shù)有2和3次,以2次為多?？梢?應(yīng)采用何種溫度、時間和次數(shù)還未能有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),有待進(jìn)行多種提取條件的比較研究。3.2.2甘薯粉的水解目前,淀粉的水解方法主要有酶解和酸解兩種。(1)淀粉酶解決方案酶解法測定淀粉認(rèn)為是最正確的方法。美國分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)和我國衛(wèi)生部都將此方法列為標(biāo)準(zhǔn)方法。AOAC專用Ronm和Hbss公司產(chǎn)的Rhozye-S酶制劑,我國衛(wèi)生部的標(biāo)準(zhǔn),用國產(chǎn)市售淀粉酶,為保證淀粉酶活性,使用前,要測定酶活力。酶解法特點是可在較溫和的條件下(60℃)進(jìn)行,由于其可在試管內(nèi)反應(yīng),且不需回流和冷卻裝置,故處理量較大,同時也可避免使用較多的酸和堿,減少污染。再者因酶的水解有特異性,故在淀粉含量少,其它多糖含量多的組織中,也不會造成高估的現(xiàn)象。因此,具有分析結(jié)果準(zhǔn)確,可靠性強(qiáng)等優(yōu)點,但因酶解速度慢,對酶活性要求嚴(yán)格,操作步驟多,技術(shù)性強(qiáng),易造成偶然誤差,故很難成為甘薯淀粉測定的快速方法。(2)酸解與酶解的比較這是早期的淀粉測定方法。至今也仍是AOAC的標(biāo)準(zhǔn)法。該法需用大量酸和堿,水解反應(yīng)常在100℃水浴中回流數(shù)小時,故能處理樣品量有限。且稀酸有時會水解少量的β-葡萄聚糖如纖維素等,對于淀粉含量較少的樣品,將產(chǎn)生較大的誤差。與酶解法相比,其選擇性和準(zhǔn)確性較差,測值往往偏高,但因其操作簡便、快速有效,至今仍是應(yīng)用最廣的方法。從文獻(xiàn)報道來看,酸解試劑有不同濃度的鹽酸和52%高氯酸等,但以鹽酸為多,其所用濃度有0.7mol/L、1mol/L、2mol/L、2%、2.4%、5%和25%等;水解溫度一般為100℃沸水,時間0.5、1、2和3h等?？傊?從已有的文獻(xiàn)報道來看,酶解因具有獨特的專一性和準(zhǔn)確性,相信一定是今后發(fā)展的必然趨勢。但從快速、經(jīng)濟(jì)實用、方便有效的角度來說,目前,酸解仍應(yīng)是最主要的甘薯淀粉分解方法。由于酸解方法本身有缺陷,且酸解本身的方法又很多,因此,有必要對各種不同的酸解方法進(jìn)行比較,以篩選一種最適方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法。3.2.3沉淀劑的沉淀性在甘薯淀粉含量測定中,因采用的方法不同,對待測試液的純度要求不一,有的需沉淀去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾,有的則否。迄今,文獻(xiàn)報道的沉淀劑有10%中性醋酸鉛溶液、30%硫酸鋅和0.15mol/LBa(OH)2溶液、30%硫酸鋅和15%亞鐵氰化鉀溶液、10%硫酸鋅溶液、4%氯化錫和5%磷鎢酸等。但對甘薯而言,因其蛋白等雜質(zhì)干擾較小,為簡化操作步驟,一般都不進(jìn)行純化,更無人去篩選其最適沉淀劑。3.2.4通過對甘薯粉的分析測定還原糖淀粉水解產(chǎn)物還原糖,可采用還原糖測定方法進(jìn)行測定。常用測糖方法有化學(xué)容量法、儀器法、色譜法等。(1)常用的分析測試方法已報道用來測定甘薯淀粉的化學(xué)方法有費林試劑熱滴定法、高錳酸鉀滴定法/Rertrand法、SHS銅試劑滴定法、FeCY試劑法、Luff-Schoor滴定法、直接滴定法和Somogyi法/薩氏法等。化學(xué)容量法準(zhǔn)確性高,但分析操作繁瑣,耗用試劑多,速度慢,技術(shù)性強(qiáng),且常會因步驟多,造成較大系統(tǒng)誤差,不適于大批樣品快速分析。但作為經(jīng)典方法仍相當(dāng)常用。因此,也有必要從中選擇一種最適定糖方法作為甘薯淀粉測定的標(biāo)準(zhǔn)容量法。(2)氧電極極譜法已報道用來測定甘薯淀粉的儀器法有旋光法、氧電極極譜法、比色法和色譜儀器法等。旋光法又分為醋酸-氯化鈣法和0.32mol/L鹽酸-旋光法。旋光法具有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,速度快等特點,較受人歡迎。前者是目前谷物淀粉測定的國標(biāo)法,后者與前者相比,具有設(shè)備簡單,技術(shù)性較弱,加熱時間短,不需油浴,節(jié)省成本,提高功效等特點,適于中高級材料的鑒定,但其具體測定步驟似有完善的必要。氧電極極譜法是通過測定葡萄糖被氧化酶氧化時耗氧量來測定葡萄糖量,并推算淀粉含量。由于該法酶穩(wěn)定性差,重現(xiàn)性差,所以,現(xiàn)幾乎很少被人應(yīng)用。這種方法的應(yīng)用關(guān)鍵在于酶制劑本身的純度和比活力。比色法是應(yīng)用最廣的方法。已被應(yīng)用于甘薯的比色法有砷鉬酸法、酚-硫酸法(490nm)、DNS法、Somagyi法、蒽酮法(anthrone法)、Laneeynon法、Hassid-neufeld法、Schoorl法、半胱氨酸硫酸法和SHS銅試劑比色法等。但以酚-硫酸法、蒽酮法和DNS法最為常用。和其他方法相比,比色法系微量或半微量法,操作繁瑣,耗用試劑多,技術(shù)性強(qiáng),速度慢,易造成誤差。但目前,仍有幾種方法常被廣泛應(yīng)用。因此有必要對這些比色法進(jìn)行比較研究,以確定一種或兩種較適合的方法。色譜儀法是較新的高級儀器分析方法。已被應(yīng)用于甘薯淀粉測定的色譜法有HPLC法、氣相色譜分析法(GC法)和糖離子色譜法,但以HPLC多。色譜儀法是近年來新發(fā)展起來的一類先進(jìn)儀器方法,其特點是不但能準(zhǔn)確測