硝酸酯類no供體oa雜合物的合成及抗肝炎藥物

硝酸酯類no供體oa雜合物的合成及抗肝炎藥物

齊墩酸是一門廣泛分布于植物表面的三級化合物。它具有多種生物活性。臨床主要用于治療肝炎、肝硬化和其他慢性肝病，且治療劑量沒有明顯副作用。研究發(fā)現(xiàn),OA給藥后主要在肝臟分布、代謝。一氧化氮(NO)在體內由NO合酶(NOS)催化氧化L-精氨酸生成。NO作為信使物質或效應分子在體內發(fā)揮重要的生理功能。NO生成不足或NO信號傳導異常與多種疾病的形成和發(fā)展密切相關,因此,外源性地補充NO、恢復NO正常信號傳導的策略使NO供體及其相關藥物應運而生。研究還發(fā)現(xiàn),NO在細胞凋亡過程中具有雙向調節(jié)作用:體內持續(xù)低濃度的NO(無論是內源性的還是外源性的)可抑制細胞凋亡,對細胞具有保護和促其生長的作用;體內高濃度的NO可產生細胞毒性,誘導腫瘤細胞凋亡,阻止腫瘤細胞的擴散和轉移。門靜脈高壓是慢性肝炎的常見并發(fā)癥,也是肝硬化病人死亡的主要原因。病理研究發(fā)現(xiàn)其形成原因是:內皮NO合酶的酶促反應減弱,導致肝臟內NO生成量不足,引起肝星狀細胞異常收縮。傳統(tǒng)硝酸酯類血管舒張劑可降低門靜脈高壓,但其系統(tǒng)性擴張血管的作用對肝炎病人危害較大。因而,如特異性地向肝臟釋放NO,而不影響系統(tǒng)的血壓,可能是治療此類肝病的理想方法。Fiorucci等選擇熊去氧膽酸(UDCA)為先導化合物,將硝酸酯類NO供體通過阿魏酸與UDCA偶連,設計合成了其NO釋放型熊去氧膽酸衍生物NCX-1000(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)NCX-1000能選擇性地在肝臟釋放NO,在動物肝損傷模型中發(fā)揮抗細胞凋亡的作用,能阻止肝腹水形成,降低門脈壓。受此啟發(fā),作者曾以對肝組織具有高度親和力的OA為先導物,將硝酸酯類NO供體經抗氧連接基團與OA28-COOH相連,設計合成了一系列結構新穎的NO-OA雜合衍生物。初步生物活性研究顯示,此類衍生物可釋放母體藥物OA及低濃度的NO,抑制肝細胞凋亡,發(fā)揮兩者的協(xié)同保肝活性,其中化合物ZCII2(圖1)的活性最強。為深入探討NO供體與OA不同位置偶聯(lián)對保肝活性的影響,并進一步研究此類化合物的構效關系,尋找新型抗肝炎藥物。本文在前期研究基礎上,分別選取含香草酸(2,vanillicacid)、阿魏酸(ferulicacid)及對羥基桂皮酸(p-hydroxycinnamicacid)等抗氧劑的連接基團,通過它們將硝酸酯類NO供體與OA的3位OH偶聯(lián),設計合成了10個衍生物10a、10b、11a~11e和12a~12c,并進行了相關生物活性篩選。結果與討論1中間體3、3b、3a4e及55以香草醛(vanillin)為原料,經氫氧化銀氧化得香草酸鈉1,酸化得香草酸2。香草酸、阿魏酸及對羥基桂皮酸分別與相應的二溴烷烴或二溴烯烴反應得重要的溴代有機酚酸酯類中間體3a、3b、4a~4e及5a~5c,見合成路線1。OA在4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下與琥珀酸酐反應,得3-O-琥珀酸單?；苌?,6分別與上述中間體3a、3b、4a~4e及5a~5c在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、DMAP催化下進行酯化反應,得產物7a、7b、8a~8e及9a~9c,最后在避光條件下與硝酸銀反應分別得目標化合物10a、10b、11a~11e及12a~12c(合成路線2)。所有目標化合物的結構均經IR、MS和1HNMR確證,其熔點、元素分析及圖譜數(shù)據見表1和表2。2藥理學實驗的結果2.1整體研究結果采用LDH法,以母體藥物OA及NCX-1000為陽性對照測試了所有目標物抗Fas介導的HepG2細胞凋亡活性,結果見圖2。初步研究結果顯示,OA在測試條件下難以抑制HepG2細胞凋亡;而NCX-1000,在1×10-6mol·L-1濃度下可以保護33.4%的HepG2細胞使其免于抗Fas介導的細胞凋亡,此結果與之前的報道一致;受試的目標化合物中,12a顯示較強的細胞保護作用,其活性與NCX-1000相當,提示此作用可能與NO釋放有關。2.2a和ncx-400在不同時間下的o釋放率為進一步研究活性化合物12a的作用機制,采用Griess試劑法,測定了12a及陽性對照NCX-1000的體外NO釋放情況。如圖3所示,12a及NCX-1000在300min時分別達到最大值29ng·mL-1和28ng·mL-1,二者結果相近。相同實驗條件下ZCII2的NO最大釋放量為12ng·mL-1而具有明顯抗腫瘤活性的呋咱氮氧化物(furoxan)類NO供體型OA衍生物ZCVI4的NO最大釋放量達60ng·mL-1。3抗fas抑制劑活性由于與正常肝細胞具有相同的生物學活性,HepG2人肝腫瘤細胞株廣泛應用于遺傳毒理學及病毒培養(yǎng)等方面研究肝病的發(fā)病機制。因此,在體外活性檢測中采用HepG2細胞作為本文的肝病研究模型。Fas分子被稱為“死亡分子”,其表達強度與肝細胞的損傷程度有密切的關系。Fas分子系統(tǒng)作為目前肝病領域新的研究熱點,進展十分迅速。大量的研究結果顯示Fas介導的細胞凋亡與病毒性肝炎引起的肝損害密切相關,抑制肝細胞Fas表達將有助于減輕肝細胞損傷的程度。本文采用LDH法,測試了所有目標化合物抗Fas介導的HepG2細胞凋亡活性,與陽性對照NCX-1000類似,化合物12a顯示較強的抑制HepG2細胞凋亡作用,而相同條件下OA未見此作用;進一步的體外NO釋放測試結果提示,12a及NCX-1000抑制細胞凋亡活性可能與釋放較低濃度的NO有關。與此形成鮮明對照的是,具有較強抗腫瘤活性的呋咱氮氧化物類NO供體型OA衍生物ZCVI4,在相同實驗條件下,體外可釋放高濃度的NO(約為12a及ZCII2的2~5倍)。這些初步研究結果進一步驗證了NO在細胞凋亡中的雙向調節(jié)作用,即低濃度的NO可抑制細胞凋亡,具有保護細胞的作用;而高濃度的NO,則具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。初步構效關系分析可知:對于硝酸酯類NO-OA雜合物,連接基團及硝酸酯偶聯(lián)位置對其抑制HepG2細胞凋亡活性有較大影響,含有抗氧連接基團的衍生物一般具有較強的細胞保護作用。但總體來說,與先前的研究結果比較,同樣均含抗氧連接基團,本文所合成的OA的3-OH硝酸酯偶聯(lián)物除12a外總體活性弱于OA的28-COOH硝酸酯偶聯(lián)物(如ZCII2);而相同碳鏈長度的連接基團,含烯烴的衍生物活性較強(11e>11c)。此類新型NO-OA雜合物的體內活性及作用機制尚有待進一步研究。光譜及元素分析熔點用毛細管法測定(溫度未校正),IR譜用NicoletImpact410型傅里葉變換紅外光譜儀測定(KBr壓片法);1HNMR用BrukerAMX-300型核磁共振儀測定(TMS為內標);MS譜用HP1100LC/MSD質譜儀測定;元素分析用ElementarVarionELIII型元素分析儀測定。試劑均為市售化學純或分析純產品除特別說明外,不經處理直接使用。1以2h-5e5e,5a5e,5a5e,5e5e5e5e5e5e5e5e,5e5e5e5e5e5e5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸5e,5-羥基苯甲酸5-溴丙烯酸鹽系苯甲醛3a5e5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯甲酸5-2-甲基苯甲酸5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯甲酸5-2-甲基苯丙酸5e,5-2-甲基苯丙酸5e,5e,5a5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e,5e-10-針對10e-10e-10-針對10e-10-氯苯丙酸方,10.2,10.7-10.2,10.2,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.74-羥基-3-甲氧基苯甲酸(2,香草酸)硝酸銀(17.0g,0.1mol)加入100mL蒸餾水,攪拌使溶解,緩慢加入氫氧化鈉溶液(4.4gNaOH溶于40mL蒸餾水),室溫攪拌10min,使氧化銀沉降,用蒸餾水以傾瀉法洗3次,將濕的氧化銀用20mL蒸餾水覆蓋,加2g氫氧化鈉,充分攪拌,趁熱一次加入香草醛15.2g,繼續(xù)攪拌約20min,過濾,熱水洗,濾液通入SO25~10min,鹽酸酸化(pH約為2),冷卻后過濾,水洗,干燥,得香草酸11.5g。收率65.3%,mp208~210℃。4-羥基-3-甲氧基苯甲酸-3-溴丙酯(3a)2(4.33g,25.8mmol)溶于50mL丙酮中,加1,3-二溴丙烷(23.6g,100mmol)、三乙胺10mL,外溫50℃加熱反應4h,冷卻至室溫,有大量白色固體析出,過濾,濾液濃縮,柱色譜分離得針狀固體4.53g。收率61.2%,mp102~104℃。4-羥基-3-甲氧基苯甲酸-4-溴丁酯(3b)方法同3a,由2與1,4-二溴丁烷制得,收率65.1%,mp76~78℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-2-溴乙酯(4a)方法同3a,由阿魏酸(ferulicacid)與1,2-二溴乙烷制得,收率67.3%,mp102~104℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-3-溴丙酯(4b)方法同3a,由阿魏酸與1,3-二溴丙烷制得,收率68.3%,mp100~102℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-4-溴丁酯(4c)方法同3a,由阿魏酸與1,4-二溴丁烷制得,收率70.1%,mp96~98℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-6-溴己酯(4d)方法同3a,由阿魏酸與1,6-二溴己烷制得,收率61.5%,mp90~92℃。4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-4-溴-2-丁烯酯(4e)方法同3a,由阿魏酸與1,4-二溴-2-丁烯制得,收率69.1%,mp92~94℃。4-羥基苯丙烯酸-2-溴乙酯(5a)方法同3a,由對羥基桂皮酸(p-hydroxycinnamicacid)與1,2-二溴乙烷制得,收率68.5%,mp104~106℃。4-羥基苯丙烯酸-3-溴丙酯(5b)方法同3a,由對羥基桂皮酸與1,3-二溴丙烷制得,收率73.0%,mp98~100℃。4-羥基苯丙烯酸-4-溴丁酯(5c)方法同3a,由對羥基桂皮酸與1,4-二溴丁烷制得,收率71.2%,mp96~98℃。3-O-琥珀酸單酰基-齊墩果酸(6)OA(2.50g,5.48mmol)、丁二酸酐(2.19g,21.9mmol)、DMAP(0.668g,5.48mmol)、無水CH2Cl2(60mL)依次加入反應瓶中,加熱回流反應48h。反應液水洗3次,有機層無水Na2SO4干燥;過濾,濾液濃縮,柱色譜分離得產品1.70g,收率53.1%。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(3-溴-丙氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(7a)6(556mg,1mmol)、3a(288mg,1mmol)、DCC(206mg,1mmol)及催化量的DMAP、無水CH2Cl210mL分別加入反應瓶,室溫攪拌反應,過濾,濾液減壓濃縮,柱色譜分離得產品500mg,收率60.6%。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(4-溴-丁氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(7b)方法同7a,由6和3b反應制得,收率58.3%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(2-溴-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(8a)方法同7a,由6和4a反應制得,收率72.4%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(3-溴-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(8b)方法同7a,由6和4b反應制得,收率79.3%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(4-溴-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(8c)方法同7a,由6和4c反應制得,收率68.0%。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(6-溴-己氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(8d)方法同7a,由6和4d反應制得,收率61.2%。3-O-[4-(2-甲氧基-4-{2-[4-溴-(2-丁烯氧羰基)]-乙烯基}-苯氧)-琥珀酰基]-齊墩果酸(8e)方法同7a,由6和4e反應制得,收率64.5%。3-O-{4-[2-(2-溴-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?齊墩果酸(9a)方法同7a,由6和5a反應制得,收率75.4%。3-O-{4-[2-(3-溴-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?齊墩果酸(9b)方法同7a,由6和5b反應制得,收率72.3%。3-O-{4-[2-(4-溴-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?齊墩果酸(9c)方法同7a,由6和5c反應制得,收率75.1%。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(3-硝氧基-丙氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(10a)反應瓶中依次加入7a(58.6mg,0.071mmol)、硝酸銀(18mg,0.11mmol)、乙腈(5mL),避光攪拌回流反應過夜,有溴化銀黃色沉淀生成。反應結束后,過濾,濾液濃縮,柱色譜分離得產品36.2mg,收率58.8%,mp98~100℃。3-O-{4-[2-甲氧基-4-(4-硝氧基-丁氧羰基)-苯氧]-琥珀?；鶀-齊墩果酸(10b)方法同10a,由7b制得,收率57.9%,mp110~112℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(2-硝氧基-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(11a)方法同10a由8a制得,收率60.1%,mp70~72℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(3-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀酰基)-齊墩果酸(11b)方法同10a由8b制得,收率56.3%,mp90~92℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧基-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(11c)方法同10a,由8c制得,收率69.5%,mp114~116℃。3-O-(4-{2-甲氧基-4-[2-(6-硝氧基-己氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(11d)方法同10a由8d制得,收率59.2%,mp120~121℃。3-O-[4-(2-甲氧基-4-{2-[4-硝氧基-(2-丁烯氧羰基)]-乙烯基}-苯氧)-琥珀酰基]-齊墩果酸(11e)方法同10a,由8e制得,收率51.4%,mp96~98℃。3-O-(4-{4-[2-(2-硝氧基-乙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(12a)方法同10a,由9a制得,收率75.0%,mp110~112℃。3-O-(4-{4-[2-(3-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(12b)方法同10a,由9b制得,收率68.1%,mp124~126℃。3-O-(4-{4-[2-(4-硝氧基-丁氧羰基)-乙烯基]-苯氧}-琥珀?；?-齊墩果酸(12c)方法同10a,由9c制得,收率57.5%,mp108~110℃。2藥理學實驗2.1gml-1及不同濃度