比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量課件

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蘋(píng)果組織

可溶性蛋白含量2011級(jí)化學(xué)生物學(xué)

吳凡郭夢(mèng)雨比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量1

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2實(shí)驗(yàn)實(shí)施3結(jié)果分析4結(jié)論2比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

果蔬可溶性蛋白質(zhì)含量是果蔬品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。許多可溶性蛋白是構(gòu)成果蔬中酶的重要組成部分，參與果蔬多種生理生化代謝過(guò)程的調(diào)控。因此，果蔬組織可溶性蛋白含量的測(cè)定就顯得尤為重要。3比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下時(shí)最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。4比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)原理5比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

考馬斯亮藍(lán)法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑；干擾物質(zhì)少缺點(diǎn)：去污劑、、十二烷基硫酸鈉等干擾測(cè)定；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)有輕微非線(xiàn)性6比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)實(shí)施主要儀器及試劑：分光光度計(jì)；電子天平;容量瓶

25ml十個(gè)；50ml

燒杯2個(gè)；BSA新鮮蘋(píng)果；Tris、外援添加物等7比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)實(shí)施(1)試劑的配制：·標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備：配制100μg/mL的BSA溶液·提取緩沖溶液：pH

7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl緩沖液(100mmol/L)·梯度濃度Tris-HCl緩沖液(pH9.0)：10、30、50、80、100mmol/L·外援添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、抗壞血酸(2mmol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、、半胱氨酸(2mmol/L)、β-巰基乙醇(2%，V/V)8比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)實(shí)施（2）實(shí)驗(yàn)操作步驟稱(chēng)取蘋(píng)果果肉1g加入不同緩沖液5mL，研磨離心，取上清液8mL低溫保存

9比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)實(shí)施實(shí)驗(yàn)操作步驟開(kāi)啟分光光度計(jì)，預(yù)熱20分鐘標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

待測(cè)液的測(cè)定

10比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析表一：不同吸光度值對(duì)應(yīng)BSA含量BSA含量μg020406080100吸光度A00.1440.2680.3660.4470.541線(xiàn)性回歸率為0.9990，線(xiàn)性方程y=186.33X-4.8440

。11比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析不同緩沖體系對(duì)可溶性蛋白提取效果的影響1.不同緩沖液及其pH1-11分別代表水、pH為7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl緩沖溶液12比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析2.不同濃度1-6分別表示濃度為0、10、30、50、80、100mmol/L的pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液13比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析3.不同外援添加物A-J分別代表抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巰基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巰基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巰基乙醇14比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析蘋(píng)果組織可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定項(xiàng)目吸光度蛋白含量μg蛋白含量%平均值%10.26043.6034.8834.9320.26344.1635.3330.25843.2334.5815比色法測(cè)定蘋(píng)果中可溶蛋白質(zhì)含量結(jié)論

實(shí)驗(yàn)最終確定的適用于蘋(píng)果果實(shí)可溶性蛋白含量測(cè)定的提取條件為，0.1mol/L,pH為9.0的Tris-HCl提取緩沖液(內(nèi)含1mol/LEDTA和1%PVP)，此條件下，果實(shí)可溶性蛋白的有效測(cè)定含量為34.93%（mg/g）