一種快速、特異性、快速檢測登革型病毒sybrmaer-2方法的建立

一種快速、特異性、快速檢測登革型病毒sybrmaer-2方法的建立

登陸熱（df）是登陸病毒引起的。這是一種重要的熱帶和亞熱帶害蟲傳播疾病。該病主要通過埃及伊蚊(Aedesaegytpi)和白蚊伊蚊(Aedesalbopitus)傳播,全世界每年約有5000萬～1億登革病毒新發(fā)感染病例,傳播范圍遍及亞洲、非洲和南美洲的100多個國家。在我國,登革熱屬于輸入性疾病,曾在廣東、廣西、云南、臺灣、香港、澳門等地發(fā)生過不同程度的流行。隨著旅游業(yè)的發(fā)展、人口流動性增大以及全球氣候變暖等因素的影響,蚊傳疾病肆虐,嚴重威脅著熱帶和亞熱帶地區(qū)人民的身體健康。登革病毒有DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4等4個血清型,其中DENV-2傳播最為廣泛,流行最為頻繁和嚴重。登革病毒感染者缺乏特征性臨床癥狀,臨床診斷主要依賴于實驗室檢查,主要有血清學和分子生物學方法。在病毒感染的早期,機體還未產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,不適合進行血清學檢測。采用高度特異性的RT-PCR和熒光定量PCR方法檢測急性期血清樣品,具有特異性強、敏感性高、簡便快速等特點。本研究利用DENV-2特異性保守區(qū)設(shè)計引物,建立SYBRGreenⅠqRT-PCR,通過對DENV-2及其他相關(guān)病毒的檢測,評價試驗的特異性、敏感性和重復性,通過Sanger測序進行驗證,并對4份DENV-2RT-PCR陽性血清和10份陰性血清進行檢測。材料和方法1材料表面1.1病毒病毒屬genusbv和流感病毒,包括病毒、拉沙病毒、黃熱病毒DENV-1Hawaii株(GenBank序列號:EU848545)、DENV-2NewGuineaC株(GenBank序列號為AF038403)、DENV-3H87株(GenBank序列號:M93130)、DENV-4H241株(GenBank序列號:AY947539)、A型流感病毒、拉沙病毒和黃熱病毒,均為瑞典國家傳染病控制研究所生物安全三級實驗室保存。1.2血清2005年由瑞典國家傳染病研究所利用RT-PCR診斷登革Ⅱ型病毒感染的人血清14份,其中4份陽性,10份陰性。1.3astermatch、選取、融資試劑、SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒,美國Invitrogen公司產(chǎn)品;QIAampMinEluteViralSpin試劑盒,荷蘭Qiagen公司產(chǎn)品;2×SYBRGreenMasterMix、BigDye?Terminatorv1.1CycleSequencing試劑盒、BigDye?XTerminatorTM純化試劑盒、BigDye?XTerminatorTMPurificationKit和VeritiTM96-wellFastplate,美國AppliedBiosystems公司產(chǎn)品。PCR9800system、ABIPRISM7500、7900HTSequenceDetectionSystem和ABIPrism3130xlGeneticAnalyzer測序儀,美國AppliedBiosystems公司生產(chǎn)。2方法2.1病毒培養(yǎng)4個血清型登革病毒、A型流感病毒、拉沙病毒和黃熱病毒均在Vero細胞上進行培養(yǎng)。2.2兩種水相的脫鹽效果將5μl病毒細胞培養(yǎng)上清與120μl健康血清混合,按TrizolLSReagent說明書提取RNA。取200μlRNA水相,采用QIAampMinEluteViralSpinKit進一步提純,并以30μl的洗脫液溶解。另提取未混合病毒的健康人血清RNA,轉(zhuǎn)移200μl或400μl血清RNA水相于同一過濾柱1次或2次,分別獲得正常濃度或2倍濃縮的人血清RNA。所有提取的病毒RNA小體積分裝,-60℃保存?zhèn)溆谩?.3引用材料的設(shè)計與合成2.4lnase-/分質(zhì)機關(guān)系作用將A液(內(nèi)含500μmol/LdNTP、167μmol/L隨機引物、5.33μlRNase-free水和5μl提取的RNA)分別置65℃和4℃5min后,加入7μlB液(含有1μlSuerscriptⅢ、1μlRNaseOUT、1μlDTT和4μl5×緩沖液),再分別以50℃和55℃作用30min。2.5denv-2ysbrgrenqt-pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化2.5.1反應(yīng)溫度的影響12.5μl2×SYBRGreenMasterMix,20nmol/LD2St-F和D2St-R的混合物(D2St)和5μlcDNA,最后用DEPC水補足至25μl。反應(yīng)條件:50℃2min,95℃10min;95℃變性15s,分別以不同的溫度(60、61、62、63或64℃)退火60s,共40個循環(huán)。熔解曲線分析:95℃15s、60℃1min和95℃15s。每個模板至少做2個重復。擴增反應(yīng)在ABIPRISM7500/7900RealtimePCRSystem上進行。用SDSv1.3.1軟件分析擴增結(jié)果,并采用軟件自動分析程序獲得閾值(threshold)和閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。2.5.2denv-2cda的檢測選擇不同濃度的上游引物(D2St-F)和下游引物(D2St-R),分別對5倍梯度稀釋的DENV-2cDNA進行定量分析(采用2.5.1選擇的退火溫度),每個稀釋度做3個重復,并以健康人血清RNA作為對照。2.6血清rna的檢測以18SF/R和28SF/R作為引物,利用常規(guī)SYBRGreenⅠqRT-PCR程序?qū)】等搜錜NA樣品中的18SrRNA和28SrRNA進行定量。2.7denv-2sybr-pcr檢測以其他3個血清型的登革病毒、A型流感病毒、拉沙病毒和黃熱病毒RNA作為陰性對照(NC),以健康人血清RNA作為血清對照(SC)進行DENV-2SYBRGreenⅠqRT-PCR,觀察試驗的特異性。2.8血清標準血清中na將DENV-2RNA與2倍濃縮的人血清RNA按1∶1的比例混合,制備含320、80、20、5個拷貝/μl的標準血清樣品,利用D2StqRT-PCR系統(tǒng)進行檢測。2.9合成cdna的檢測以2個不同稀釋度的DENV-2RNA為模板合成cDNA,每個濃度分2個樣品同時檢測,觀察組內(nèi)重復性;每個樣品的cDNA產(chǎn)物重復2次qRT-PCR定量分析,觀察組間重復性。2.10循環(huán)序列分析將特異性和敏感性試驗的D2StqRT-PCR產(chǎn)物稀釋10倍,作為Sanger測序的模板,驗證qRT-PCR檢測結(jié)果。主要步驟:以D2St-F作為測序引物,使用BigDye?Terminatorv1.1CycleSequencing試劑盒對測序模板進行循環(huán)擴增,循環(huán)參數(shù)為:96℃預變性1min;96℃0s、50℃0s、60℃延伸30s,共25個循環(huán)。使用BigDye?TerminatorTMPurification試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化,然后在ABIPrism3130xlGeneticAnalyzer儀中進行Sanger測序,利用SequenceScannerV1.0軟件對測序結(jié)果進行分析,包括可讀序列的信號強度、序列長度(讀長)以及背景信號的影響等。將有效讀長的序列放入GenBank國際數(shù)據(jù)庫系統(tǒng),進行BLAST分析,并利用MegAlign軟件與4個血清型登革病毒的一致序列進行比較。2.11denv-2sybr-pcr檢測DENV-2RT-PCR陽性血清4份,陰性10份,采用新建的DENV-2SYBRGreenⅠqRT-PCR方法進行檢測,以健康人血清RNA作為陰性對照。結(jié)果1denv-2ysbrgrenqt-pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化1.1特異性熔解峰的確定當退火溫度為64℃時,經(jīng)D2StqRT-PCR擴增獲得的熔解曲線最佳,無非特異性熔解峰出現(xiàn),僅在79℃左右有一個特異性的熔解峰(圖1)。因此選擇64℃的退火溫度進行D2StqRT-PCR。1.2循環(huán)閾值相關(guān)值的分析將提取的DENV-2RNA進行連續(xù)5倍遞增稀釋,以不同的引物濃度進行D2StqRT-PCR反應(yīng),得出的4條標準曲線的相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。模板的拷貝數(shù)與循環(huán)閾值(Ct)的相關(guān)值(R2)均大于0.99,呈線性關(guān)系,其中D1St-F/D1St-R的濃度比例為10nmol/L/10nmol/L時,斜率(Slope)為-3.56,擴增效率最高,為91%,對應(yīng)的擴增曲線與標準曲線見圖2、3。初始模板cDNA獲得的平均Ct值為10.7,在PCR反應(yīng)中的含量為1.7×108個拷貝[(1+0.91)(40-10.7)]。血清RNA對照未檢測到任何擴增信號。2熔解峰和ct值利用18S和28SrRNASYBRGreenⅠqRT-PCR定量分析健康人血清中的18SrRNA和28SrRNA,均被特異性擴增,熔解峰分別出現(xiàn)在81℃和78.6℃左右,平均Ct值分別為18.3和17.0。而2倍濃縮的健康人血清中的18SrRNA和28SrRNA獲得的平均Ct值分別為17.5和16.2,與健康人血清RNA獲得的Ct值相差大約1個Ct,恰好是2倍濃縮后的濃度,與預期結(jié)果相符,所以2倍濃縮的健康人血清RNA可以按照1∶1的比例與病毒RNA混合,從而使標準血清中含有正常濃度的人血清RNA。3pcr特異性檢測對DENV-1、DENV-3、DENV-4、A型流感病毒、拉沙病毒、黃熱病毒及健康人血清RNA進行D2StqRT-PCR檢測,均沒有交叉反應(yīng),說明該方法特異性良好。4pcr檢測ct值含320、80、20和5個拷貝/μl的DENV-2血清樣品進行D2StqRT-PCR檢測,獲得的擴增曲線見圖4,獲得的Ct值見表2。隨著模板拷貝數(shù)的減少,Ct值逐漸升高,但當模板濃度為5個拷貝/μl時,未檢測到熒光信號。即該方法的敏感性為20個拷貝/μlRNA,相當于25個拷貝/反應(yīng),或5個拷貝/μl血清。5相似樣品的檢測經(jīng)D2StqRT-PCR定量分析,相同樣品濃度的2份樣品或同一樣品的2次重復檢測均獲得相似的Ct值,擴增曲線各自重合(圖5)。6假陰性序列和假陰性序列對特異性和敏感性檢測的qRT-PCR產(chǎn)物進行Sanger測序,所有特異性檢測的qRT-PCR產(chǎn)物均未獲得可讀的序列,則特異性檢測結(jié)果正確,不是假陰性結(jié)果;敏感性檢測的擴增產(chǎn)物中,除以5個拷貝/μlRNA為模板的qRT-PCR產(chǎn)物未檢測到測序信號外,其他陽性擴增產(chǎn)物都獲得了可讀的序列(表2),經(jīng)BLAST分析,與實驗室標準株DENV-2NewGuineaC的一致率均在93%以上,則敏感性檢測結(jié)果正確,不是假陽性結(jié)果。7s1stqlt-pcr檢測結(jié)果DENV-2RT-PCR陽性血清4份,陰性血清10份,應(yīng)用D2StqRT-PCR檢測結(jié)果一致。陽性樣品擴增產(chǎn)物的Ct值見表2,對應(yīng)的擴增曲線見圖6,健康人血清RNA對照未檢測到任何熒光信號。denv-2sybr-pcr擴增檢測在常規(guī)實驗室診斷方法中,病毒分離鑒定是診斷登革熱的金標準,然而病毒分離培養(yǎng)費時、敏感性低,因此達不到早期快速檢測的目的。血清學診斷因抗登革病毒的抗體與其他黃病毒存在廣泛的交叉反應(yīng)而受到干擾,不宜用于早期感染的診斷,但可鑒別登革病毒的初次與再次感染,因為感染一種血清型登革病毒的患者康復后還可能再次感染其他的血清型。近年來,隨著分子生物學的快速發(fā)展,PCR技術(shù)得到廣泛應(yīng)用,特別是熒光定量PCR已經(jīng)逐漸取代病毒的分離培養(yǎng),成為病毒鑒定新的金標準。目前,國外對登革病毒檢測方面的研究較為全面,如登革病毒的鑒定和分型、區(qū)分初次和再次感染。我國主要利用巢式PCR、SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR、TagMan熒光RT-PCR等方法進行登革病毒的檢測及分型。本研究建立的DENV-2SYBRGreenⅠqRT-PCR特異性檢測方法。在試驗設(shè)計方面,通過對發(fā)表的登革病毒核苷酸序列的大量分析比對,設(shè)計了DENV-2特異性的引物,可用于目前所有DENV-2毒株的檢測。在檢測試驗的敏感性時,由于標準株病毒RNA含量非常高,需要進行7個數(shù)量級左右的稀釋才能得到低拷貝的RNA樣品,樣品中的人RNA含量也被稀釋。因此,本實驗在低拷貝的RNA樣品中等體積混合了2倍濃縮的人血清RNA,這樣標準血清樣品中含有了正常水平的背景RNA,從而使該方法的敏感性試驗更加接近實際血清樣品的檢測。在優(yōu)化的擴增反應(yīng)條件下,測得試驗的敏感性為20個拷貝/μlRNA(或25個拷貝/反應(yīng)),比Gurukumar等利用TagManMGB探針檢測登革病毒得出的10個拷貝/反應(yīng)的敏感性略低,但比Yong等利用S