瘦素受體在條件性厭味大鼠腦的表達

瘦素受體在條件性厭味大鼠腦的表達

0不同途徑腦內(nèi)差異-免疫組化法檢測大鼠腦中ta條件性厭倦（cta）是將條件性厭倦（cs）的味道與伴隨的非條件性疼痛結(jié)合起來建立的對條件性疼痛的長期記憶。它的解剖基礎(chǔ)基本上是明確的，但也不完全清楚地與神經(jīng)流激（lr）結(jié)合，以減少食物，瘦素和受體是否在cta的形成和維持中發(fā)揮作用。1cta大鼠血清毒力基因表達變化成年健康雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量210～250g,由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.用顆粒型大鼠飼料喂養(yǎng),飲用蒸餾水,動物房溫度維持在18～26℃,光暗周期為12h∶12h.實驗前在上述條件下喂養(yǎng)3d.瘦素放射免疫檢測試劑盒(ratleptinRIAkit)和胰島素放射免疫檢測試劑盒(ratinsulinRIAkit)購自美國LincoRes公司,該方法的最低線形檢測下限分別為0.5μg·L-1,0.1μg·L-1,最高線形檢測上限分別為50.0μg·L-1,10.0μg·L-1,批內(nèi)和批間變異(CV)<8%,回收率>94%.一抗為抗LR羊血清,二抗為生物素標記的抗羊IgG,上述抗體和ABC試劑盒均購自美國SantaCruz公司.強生全血糖儀由美國Lifescan公司生產(chǎn).訓練動物每日08∶30/09∶00飲用蒸餾水30min,持續(xù)5d;至d6,改飲1g·L-1糖精鈉溶液(cs),測量所飲用的量,以V獲得表示,然后將動物隨機分為2組,每組10只,給組1ip0.15mo·L-1的LiCl溶液(20mL·kg-1,US),組2ip生理鹽水(20mL·kg-1),每日08∶30/09∶00繼續(xù)飲用蒸餾水30min,持續(xù)2d,d9飲用1g·L-1糖精鈉溶液,飲用量以V檢測表示.計算抑制率=1-V檢測/V獲得.選取組1中抑制率≥0.5的動物作為CTA組,組2為對照組.200g·L-1烏來糖1.2g·kg-1ip麻醉,打開胸腔,腹主動脈抽血2mL.用生理鹽水300mL經(jīng)左心室灌注沖洗,再用40g·L-1多聚甲醛(PB配制,pH7.4)300mL緩慢灌注固定.開顱取腦,40g·L-1多聚甲醛后固定6h.常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,片厚5μm.將切片分為3套:第1套做LR免疫組化染色,第2套做HE染色(與第1套切片相鄰,用于組織學定位),另1套做免疫組化對照試驗.按免疫組化ABC法進行染色,應(yīng)用3mL·L-1H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性.枸櫞酸緩沖液(pH6.0)92℃熱修復15min后,PBS洗3遍.15mL·L-1封閉血清置濕盒孵育1h(18～20℃),棄去不洗,加入抗LR羊血清(1∶100,SantaCruz,sc-1834)4℃孵育40h,PBS沖洗后加生物素標記的抗羊IgG室溫孵育3h,ABC復合物室溫孵育2h(ABCstainingsystem,SantaCruze,sc-2023),DAB顯色.常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片.免疫組化染色對照:用正常血清代替第一抗體,其余步驟不變.結(jié)果為陰性.瘦素受體的表達通過陽性細胞計數(shù)來反映.在400倍鏡下應(yīng)用測微尺計數(shù)每0.1mm2下連續(xù)5張切片陽性細胞數(shù),取1mm2計算平均陽性細胞數(shù),共測5只大鼠,再取其平均值,即平均LR-IR陽性細胞數(shù).全血可在室溫下靜置1h,1500r·min-1離心10min,取血清200μL,-20℃凍存待檢.用放免法測定血清瘦素和胰島素水平.放免藥盒標記物為125I-leptin和125I-insulin,單位為μg·L-1.統(tǒng)計學處理:采用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計分析,以α=0.05為假設(shè)性檢驗標準.數(shù)據(jù)以表示.組1中2只大鼠抑制率<50%被剔除,組2中1只大鼠死亡.CTA組大鼠抑制率為54%～87%,平均為(70±11)%.兩組大鼠平均體質(zhì)量(227±12vs226±10),血糖水平(6.2±0.2vs6.4±1.2)mmol·L-1,血清瘦素(2.2±0.4vs2.1±0.4)μg·L-1和胰島素水平(1.2±0.4vs1.4±0.6)μg·L-1,無顯著性差異(P>0.05).在CTA大鼠和對照大鼠的多個腦區(qū)均可觀察到瘦素受體免疫反應(yīng)陽性細胞(leptinreceptors-immunoreactivities,LR-IR).LR-IR為棕色顆粒,在對照組主要沉積于細胞膜,而在CTA大鼠,瘦素受體內(nèi)移,在胞質(zhì)和胞膜上表達.CTA大鼠新皮層的Ⅲ層大錐體細胞的胞體和頂樹突呈LR-IR陽性,而對照組僅胞體呈陽性(Fig1,2).與對照組大鼠相比,CTA大鼠皮層Ⅲ層、視交叉上核(suprachiasmaticnucleus)、弓狀核(ARC)、杏仁基底外側(cè)核(BLA)、海馬CA3、下丘腦外側(cè)區(qū)(LH)等核團瘦素受體表達增加(Tab1),而下丘腦前區(qū)(AH)、腦橋臂旁核(PBN)和杏仁中央核(CeA)瘦素受體表達減弱,而孤束核(NTS)瘦素受體的表達與對照大鼠無顯著性差異.3肥力原素對大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元和腦內(nèi)神經(jīng)元的作用哺乳動物味覺的喜好是通過后天的經(jīng)驗形成的,NTS,PBN,杏仁復合體(amygdaloidnuclearcomplex,AMY),LH和島葉味覺皮層(insulargustatorycortex,IGC)等核團參與信息的編碼和整合.我們發(fā)現(xiàn)CTA形成后,PBN中LR-IR表達增強,提示瘦素及其受體可能在PBN中CS與US之間聯(lián)系的建立中發(fā)揮一定作用.而且瘦素受體在CTA大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元中表現(xiàn)出內(nèi)移現(xiàn)象,表明在CTA形成和維持中,瘦素受體的功能或活性發(fā)生變化,暗示瘦素在味覺和內(nèi)臟信息相互作用機制中具有重要作用.杏仁核是瘦素受體的主要存在部位,AMY對CTA的形成和維持有著重要作用,實驗表明BLA在其中的作用尤為重要,損毀BLA的大鼠不能建立CTA,而損毀CeA不影響CTA的形成.由PBN的腹外側(cè)亞核到BLA再到IGC的纖維是CTA學習的神經(jīng)基礎(chǔ).在CTA和對照大鼠杏仁核中,均呈現(xiàn)LR-IR在BLA強表達,而在CeA表達較弱,但與對照組相比,CTA形成后,BLA和CeA中LR-IR均增強,未體現(xiàn)出二者的差異.我們發(fā)現(xiàn)瘦素受體存在于BLA和CeA,提示瘦素可能通過杏仁核參與中樞味覺的調(diào)控,從而調(diào)節(jié)食欲和攝食.瘦素受體也存在于海馬和新皮層,并