fa10的碳末端雙甘酸缺失突變體對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響

fa10的碳末端雙甘酸缺失突變體對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響

宮頸是大多數(shù)婦科疾病之一。世界上每年有50萬人新病例，約30萬人死于這種疾病，其中86%的新病例約占世界的一半。據(jù)統(tǒng)計(jì),近些年來我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升,且其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。FAT10(HLA-Fassociatedtranscript10)也叫雙泛素,是泛素樣的修飾因子家族成員之一,分子量約為18kD。FAT10結(jié)構(gòu)中包含有兩個(gè)串聯(lián)的泛素樣結(jié)構(gòu)域,分別與泛素有約30%的相似性。Hipp等研究發(fā)現(xiàn),FAT10與泛素類似,能與靶蛋白結(jié)合,并介導(dǎo)其降解,在此過程中,其碳末端雙甘酸結(jié)構(gòu)發(fā)揮了重要作用。此外有研究發(fā)現(xiàn),FAT10在肝癌、結(jié)直腸癌及宮頸癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),且干擾FAT10后可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。本研究通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建FAT10碳末端雙甘酸缺失突變體,觀察其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響,初步探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。1材料和方法1.1來自本地格式的資源收集南方醫(yī)院2013年手術(shù)切除的宮頸原位癌組織標(biāo)本及正常宮頸組織各5例,患者年齡25~65歲,平均36.4歲。1.2抗鼠flagmort-pcr檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株HeLa、真核表達(dá)載體pcDNA3.0-flag-FAT10和大腸埃希菌株DH5α由本室保存;DMEM培養(yǎng)基、OptiMEM及胎牛血清(Gibco,美國(guó));DNAladder、MutanBEST定點(diǎn)突變?cè)噭┖?TaKaRa,日本);質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(康為,中國(guó)北京);鼠抗人FAT10單克隆抗體(Abcam,英國(guó));順鉑注射劑、Anti-flagM2抗體(Sigma-Aldrich,美國(guó));Anti-β-actin、HPP標(biāo)記的抗鼠IgG(CellSignalingTechnology,美國(guó));LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國(guó));CCK-8試劑盒(碧云天,中國(guó)上海);AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(BD,美國(guó))。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及測(cè)序由Invitrogen公司(美國(guó))完成。1.3免疫組化檢測(cè)ndf-對(duì)所搜集的臨床組織標(biāo)本提取總蛋白,Westernblotting法檢測(cè)FAT10表達(dá)水平。一抗為Anti-FAT10(1:1000稀釋)、Anti-β-actin(1:1000稀釋),一抗4℃孵育過夜后,與1:5000稀釋的HPP標(biāo)記的抗鼠IgG室溫孵育1h,經(jīng)SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Thermo公司)顯色,利用KodakIS4000R圖像工作站進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。1.4引物序列及鄰接以FAT10全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板,利用MutanBEST定點(diǎn)突變?cè)噭┖?將FAT10碳末端GG突變?yōu)閂A。突變所用引物序列為:上游5'-TGATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCA-3',下游5'-CGCTACAATACAATAAGATGCCAGGAAGAG-3'。此上游引物與下游引物5'端鄰接,3'端方向相反。質(zhì)粒構(gòu)建好后,取少量重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。1.5細(xì)胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移HeLa細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。1.6westernblotting細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以3×105個(gè)/皿接種于3.5cm培養(yǎng)皿,分為4組,分別將野生型FAT10、FAT10碳末端突變體及空載體(陰性對(duì)照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞,以野生型HeLa細(xì)胞作為空白對(duì)照組。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí),按照LipofectamineTM2000說明書操作,分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載體、野生型FAT10及FAT10碳末端突變體。轉(zhuǎn)染48h后,收集各組細(xì)胞進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。一抗為Anti-flag(1:1000稀釋)、Anti-FAT10(1:1000稀釋)、Anti-β-actin(1:1000),其余步驟同1.3。4℃孵育過夜后,與1:5000稀釋的HPP標(biāo)記的抗鼠IgG室溫孵育1h,通過Thermo公司的SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色,利用KodakIS4000R圖像工作站進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。1.7cck-8轉(zhuǎn)染后光密度測(cè)定HeLa細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板,分組同上,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,分別于轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4、5天加入20μlCCK-8,繼續(xù)孵育2h后,于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在450nm處的光密度(A)值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),A值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1.8質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞以3×105個(gè)/皿接種于3.5cm培養(yǎng)皿,分組同上,待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí),分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后,各組按終濃度為5μg/ml加入順鉑誘導(dǎo)凋亡,處理24h后,進(jìn)行AnnexinV/PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。1.9實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,各組間比較采用方差分析,多個(gè)均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1fat10蛋白表達(dá)Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織和宮頸癌組織均可檢測(cè)到FAT10蛋白表達(dá),且宮頸癌組織中的蛋白表達(dá)量明顯高于正常宮頸組織(圖1)。2.2pcdna3。0-flag-fat10gg質(zhì)量轉(zhuǎn)移2.3fat十年及fat十年面臨的表達(dá)blotting檢測(cè)野生型FAT10及FAT10?GG的表達(dá)HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,收集細(xì)胞,分別用flag抗體、FAT10抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)野生型FAT10及FAT10?GG的表達(dá)情況。結(jié)果表明,野生型FAT10及FAT10?GG重組質(zhì)粒均可在HeLa細(xì)胞中有效地表達(dá),含flag標(biāo)簽的重組蛋白分子量約18kD(圖3)。2.4hela細(xì)胞增殖CCK-8法檢測(cè)顯示,與對(duì)照組和空載體組相比,過表達(dá)野生型FAT10可明顯促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖(P<0.05),在轉(zhuǎn)染后第5天,其促進(jìn)效果更為明顯(P<0.01);而過表達(dá)FAT10?GG組細(xì)胞增殖率與對(duì)照組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4)。2.5fat十年2.2.2%4.2.24.2%4.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.28.23.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23334.234.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,各組細(xì)胞經(jīng)順鉑處理24h后,過表達(dá)野生型FAT10組的細(xì)胞凋亡率(10.9%±2.0%)與對(duì)照組(22.7%±4.2%)和空載體組(24.1%±3.8%)相比明顯下降(P<0.05),而FAT10?GG組的細(xì)胞凋亡率(25.7%±5.1%)則仍處于較高水平(圖5)。3fat10促進(jìn)腫瘤的作用宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤,傳統(tǒng)的治療采用手術(shù)為主、放療為輔的方法。近幾十年來,我國(guó)的宮頸癌發(fā)病率不斷升高,且5年生存率較低,因此迫切需要探尋宮頸癌的特異性分子標(biāo)志物,為其預(yù)防及早期診斷提供理論基礎(chǔ)。FAT10是一種泛素樣蛋白修飾因子,于1996年被發(fā)現(xiàn)。早期研究發(fā)現(xiàn),FAT10在B細(xì)胞和樹狀細(xì)胞中均有表達(dá),且在一些免疫器官如胸腺、淋巴結(jié)等表達(dá)水平較高,而在其他組織中其基礎(chǔ)表達(dá)量均較低。到目前為止,FAT10的生物學(xué)功能仍知之甚少。近十年來,FAT10的研究主要集中在腫瘤方面。研究證實(shí),FAT10參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,過表達(dá)FAT10t可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,且減少喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。FAT10還可通過與MAD2(mitoticarrestdeficient2)結(jié)合,使染色質(zhì)穩(wěn)定性降低,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。綜上所述,FAT10在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用已不可忽視。因此,探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中FAT10的作用具有重要的理論和臨床意義。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌組織中FAT10的表達(dá)較正常組織明顯升高,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。過表達(dá)野生型FAT10可顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖,且對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定抑制作用。由于FAT10碳末端具有雙甘酸結(jié)構(gòu),研究者認(rèn)為此結(jié)構(gòu)能夠介導(dǎo)其與靶蛋白結(jié)合,從而促進(jìn)靶蛋白被蛋白酶體所降解,當(dāng)碳末端甘氨酸突變后,其共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)的能力消失。因此,我們推測(cè)FAT10可能主要通過其碳末端的特殊結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。為了驗(yàn)證此假設(shè),本研究首先構(gòu)建了FAT10碳末端雙甘酸突變體,將其轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖明顯