大鼠下丘腦視上核內(nèi)一氧化氮合酶和雌激素受體的分布

大鼠下丘腦視上核內(nèi)一氧化氮合酶和雌激素受體的分布

雌花是近年來研究較多的神經(jīng)類固醇激素。它的合成和釋放受到基底和垂體-腺體軸的控制。雌激素受體(ER)在下丘腦分布較廣,主要分布于視上核、室旁核、視前區(qū)和腹內(nèi)側(cè)核等核團,雌激素通過與其受體結(jié)合,參與和介導(dǎo)了下丘腦內(nèi)的諸多功能。如對下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控以及下丘腦內(nèi)神經(jīng)肽的表達和調(diào)控。雌激素與神經(jīng)營養(yǎng)因子一樣,在促進神經(jīng)元的分化、存活、保護神經(jīng)元、維持神經(jīng)元正常功能等方面起重要作用。一氧化氮(NO)是腦內(nèi)的重要信使,由一氧化氮合酶(NOS)合成,是一種氣體信息遞質(zhì)。NOS陽性神經(jīng)元的胞體和突起廣泛分布于整個下丘腦,集中分布于視上核、室旁核、下丘腦外側(cè)區(qū)和弓狀核等區(qū)域。NO和雌激素一樣都介導(dǎo)和參與了下丘腦的許多重要功能。如NO介導(dǎo)和調(diào)控催產(chǎn)素(OT)和加壓素(VP)、促性腺激素釋放激素(GnRh)的釋放,及其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,并參與突觸可塑性的形成。由于NOS與ER在分布上有共性區(qū)域,二者在視上核、室旁核均有表達,另一方面從功能上來看二者也有一定聯(lián)系,因此我們設(shè)計采用NADPH-d組織化學(xué)法和免疫組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對下丘腦視上核內(nèi)NOS和ER共存進行形態(tài)學(xué)的觀察和研究,以期為進一步探討NO與雌激素之間的內(nèi)在聯(lián)系提供形態(tài)學(xué)的依據(jù)。1材料和方法1.1飼養(yǎng)動物中心采用SD雌性大鼠30只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重220-260g,將動物置于溫暖,安靜,避強光環(huán)境下飼養(yǎng),使之適應(yīng)周圍環(huán)境保持基礎(chǔ)狀態(tài)。1.2試劑和試劑盒雌激素受體(ER)購自武漢博士德生物工程有限公司,硝基四氮唑藍(NBT)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,還原型輔酶Ⅱ-黃遞酶(NADPH-d)購自華美生物工程公司,SABC試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.3灌注pbs液大鼠麻醉后,經(jīng)左心室升主動脈依次灌入生理鹽水、4%的多聚甲醛磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)、10%的蔗糖PBS液,灌注后取腦,入4%的多聚甲醛液后固定3h,然后入20%的蔗糖PBS液(4℃)冰箱過夜。待腦組織浸泡沉底后取出,截取下丘腦部分腦組織,做冠狀面連續(xù)冰凍切片,隔3取1,片厚約40μm。1.4染色將切片分成3套,一套行NADPH-d組織化學(xué)染色,一套行ER免疫組化染色,另一套行NADPH-d/ER雙重染色。1.4.1羊抗兔igg片圖1將經(jīng)山羊血清孵育過的切片放入濃縮型兔抗ER血清(1∶100PBS稀釋)中37℃恒溫箱孵育3h,后置4℃冰箱過夜,入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG液(即用型)中,37℃恒溫箱孵育0.5h,入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37℃恒溫箱孵育0.5h,PBS液漂洗3次,DAB顯色后裱片制片。1.4.2-ndh-d-nadph-d將切片在0.01mol/L的PBS液漂洗3次后,入孵育液37℃恒溫箱孵育1.5h,孵育液組成包括:0.3%Tritonx-100,1mg/mlβ-NADPH-d,0.5mg/mlNBT的PBS緩沖液,用PBS緩沖液(pH7.4)終止反應(yīng)后,裱片制片。1.4.3正常羊血清學(xué)組pbs在NADPH-d染色的基礎(chǔ)上再行ER免疫組化染色,用0.01mol/L的PBS液(pH7.4),漂洗3次,入正常山羊血清37℃孵育1h;以后步驟同ER免疫組化染色程序。1.5比較試驗另取一只鼠腦冠狀連續(xù)切片分4組分別作以下反應(yīng)。1.5.1抗感染試驗①空白試驗:分別省去兩套染色中的NADPH-d、兔抗ER血清,分別孵育切片。②置換試驗:用正常兔血清代替兔抗ER血清。1.5.2dab/雙氧水呈色在行NADPH-d組織化學(xué)染色后,切片經(jīng)PBS液漂洗,直接進行ER免疫組化染色中的DAB/雙氧水呈色步驟,證實是否有殘余的NADPH-d、NBT與DAB反應(yīng)而導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物混雜。1.6mpusbl2顯微檢測先于明視野顯微鏡下對各切片逐一觀察,后用OlympusC-5050ZOOM數(shù)碼相機在OlympusBH2顯微鏡下攝片。每只動物選片5張,每張切片測4個視野,在捷達801形態(tài)圖像分析系統(tǒng)下進行圖像分析,分別計數(shù)下丘腦視上核內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目,ER陽性神經(jīng)元數(shù)目及NOS/ER雙染神經(jīng)元數(shù)目和測量其各自神經(jīng)元截面直徑,并計算出雙染神經(jīng)元數(shù)占所有神經(jīng)元的百分比。2結(jié)果2.1nos陽性神經(jīng)元NOS陽性神經(jīng)元在視上核內(nèi)分布廣泛,呈內(nèi)側(cè)稍寬的帶狀分布于視交叉的外上部,大部分集中分布在視上核的背內(nèi)側(cè)部和背外側(cè)部。視上核NOS陽性神經(jīng)元密集成團簇狀,NOS陽性神經(jīng)元呈藍色或藍黑色,細胞核不著色,胞質(zhì)著色,胞體上發(fā)出的突起清晰可見,胞體和樹突的極性與核團長軸平行。NOS陽性神經(jīng)元以梭形或橢圓形細胞多見,胞體較大,胞質(zhì)著色較深,胞核透亮,可見到突起交織成叢和“串珠”樣外觀。細胞以大細胞為主,偶見小細胞型,直徑多在15-20μm(圖1,2,見封3)。2.2外側(cè)部er陽性神經(jīng)元/類型分布ER陽性神經(jīng)元在視上核的表達不及NOS陽性神經(jīng)元廣泛,集中分布于視上核的外側(cè)部,視上核的ER陽性神經(jīng)元呈棕黃色,胞核著色較深,胞質(zhì)著色不明顯。ER陽性神經(jīng)元多呈卵圓形,突起不明顯,偶可見較短突起。少數(shù)細胞著色較深,絕大多數(shù)著色較淺,但細胞輪廓清晰,分布較密集(圖3,見封3)。2.3nos及er雙染陽性神經(jīng)元形態(tài)觀察下丘腦區(qū)NOS及ER雙染陽性神經(jīng)元分布廣泛,多見于視上核、室旁核、下丘腦外側(cè)區(qū)等部,其中視上核NOS及ER雙染陽性神經(jīng)元表達最強,分布最廣。在視上核,低倍鏡下可見藍染的NOS陽性神經(jīng)元和散在其中的淡染的呈棕黃色的ER陽性神經(jīng)元以及大量的雙染陽性神經(jīng)元。NOS和ER雙染神經(jīng)元胞質(zhì)呈藍色,胞核呈棕黃色。高倍鏡下,NOS神經(jīng)元著色深,呈藍或藍黑色,密集成簇,胞體上發(fā)出的突起清晰可見。少數(shù)細胞突起較長,直徑較粗,多伸向視交叉腹側(cè),與遠端的雙染神經(jīng)元突起交織在一起,可見明顯的“串珠”樣外觀。ER神經(jīng)元著色淡,多散在分布,胞體多呈梭形或橢圓形,可見到有突起發(fā)出,但數(shù)目不多,偶可見到突起相互交織。雙染神經(jīng)元胞核呈棕黃色,有的透亮,胞質(zhì)藍染,細胞多呈梭形或橢圓形,突起明顯,呈“串珠”樣外觀。在少數(shù)雙染的陽性神經(jīng)元中,還可見到胞核內(nèi)深染的核仁。視上核雙染神經(jīng)元胞體較大,直徑達20μm左右,多為大細胞型神經(jīng)元。NOS及ER雙染陽性神經(jīng)元多位于視上核的背外側(cè)和背內(nèi)側(cè)部。在視上核內(nèi)雙染神經(jīng)元占70%-80%(圖4,見封3)。對照試驗分別省去NADPH-d和兔抗ER血清,不出現(xiàn)相應(yīng)的染色陽性結(jié)果。用正常的兔血清代替兔抗ER血清,也不出現(xiàn)陽性免疫反應(yīng),表明本實驗無抗體交叉反應(yīng)存在。呈色混合試驗陰性,表明兩套反應(yīng)程序之間互相不干擾,具有一定的特異性。3討論3.1no、no的誘導(dǎo)國內(nèi)外資料顯示,雌激素在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)有一個廣泛的生理學(xué)效應(yīng),如調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌活動,機體自律活動調(diào)節(jié),神經(jīng)保護效應(yīng)及提高認識活動等,這些效應(yīng)都是通過NO介導(dǎo)和影響的。婦女絕經(jīng)后冠心病用E2治療后,NOSⅢ在血管內(nèi)皮表達增高,在腦內(nèi)許多區(qū)域可見NOS表達增多,在海馬神經(jīng)元中,NO介導(dǎo)了E2誘導(dǎo)神經(jīng)突觸的產(chǎn)生。在去勢的大鼠體內(nèi)已經(jīng)證實了E2對因生理壓力應(yīng)激引起的血壓增高有削弱作用,這個影響是由腦內(nèi)的NO介導(dǎo)的。所有這些資料表明,NO在雌激素對神經(jīng)組織的作用上是一個很重要的介質(zhì)。研究進一步發(fā)現(xiàn),在人的SK-N-SH細胞體外培養(yǎng)中證實E2能誘導(dǎo)NO產(chǎn)生,并且E2是通過活化cNOS(即nNOS和eNOS特定組成合酶)而產(chǎn)生NO的,這個過程受細胞內(nèi)外Ca2+調(diào)控。上述實驗為NO介導(dǎo)雌激素作用提供了強有力的證據(jù)。即NO是雌激素作用ER后,產(chǎn)生的第二信使,介導(dǎo)和完成了雌激素的作用。本實驗中發(fā)現(xiàn)在下丘腦視上核可見NOS與ER雙染神經(jīng)元,使得NO介導(dǎo)雌激素受體的作用在形態(tài)學(xué)上得到了證明。3.2er和vp神經(jīng)元的調(diào)控本實驗發(fā)現(xiàn)視上核和室旁核均有NOS與ER雙染的神經(jīng)元,且表達較強。視上核的雙染神經(jīng)元多分布在背內(nèi)側(cè)和背外側(cè)部。視上核的神經(jīng)元可分為大細胞和小細胞兩種分泌神經(jīng)元。視上核主要以大細胞分泌神經(jīng)元為主,主要分泌催產(chǎn)素(OT)和加壓素(VP)。國外研究表明NOS與VP和OT神經(jīng)元分布有共存。在成年大鼠下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)中NOS可與加壓素及催產(chǎn)素共存,NO能調(diào)節(jié)VP和OT的釋放,NO是由視上核和室旁核大細胞型神經(jīng)分泌細胞的功能活躍增加而產(chǎn)生的。在等滲、有效循環(huán)血量正常時,NO抑制OT和VP的分泌;當(dāng)失血、脫水、血容量減少時,NO對VP神經(jīng)元抑制作用減弱,而對OT神經(jīng)元的抑制卻加強了。其作用機制是優(yōu)先釋放VP,對抗或更正身體水分的失衡。在去勢大鼠,45%-98%的OT與88%-99%的VP神經(jīng)元含有ERβ(雌激素β受體),ERβ和VP神經(jīng)元共存于視上核背外側(cè)部,在室旁核ERβ和VP共存于大細胞后外側(cè)區(qū)。ERβ與OT神經(jīng)元雖也有雙標(biāo),但在室旁核(PVN)和視上核(SON)都較少,主要是在PVN內(nèi)。在高滲狀態(tài)下ERβmRNA表達下降,同時ERβ也下降,證明ERβ對滲透壓改變呈負相關(guān)?？梢钥闯?NO和ER對OT和VP的分泌都起到了調(diào)控的作用,二者對VP的調(diào)節(jié)都呈負向的調(diào)節(jié)。ER在受高滲刺激時,它表達減弱,而NO在等滲狀態(tài)時抑制VP和OT釋放。有報道表明,睪酮、雙氫睪酮、皮質(zhì)醇同樣可以抑制因滲透壓改變引起的VP釋放,類固醇激素對因滲透壓改變引起的VP釋放的抑制作用很可能是通過興奮性氨基酸(谷氨酸)來介導(dǎo)完成的。NOS與谷氨酸受體在下丘腦神經(jīng)垂體軸及室周器分布廣泛,γ-氨基丁酸對大細胞型神經(jīng)分泌細胞的神經(jīng)支配在此處也較廣。其機制為谷氨酸通過與N-methyl-D-aspartate(NMDA)型谷氨酸受體結(jié)合后使NO釋放,進而使γ-氨基丁酸能神經(jīng)元活性增加,抑制大細胞型神經(jīng)分泌細胞分泌OT和VP。結(jié)合本實驗結(jié)果,ER與NOS神經(jīng)元在PVN和SON共存,主要分布在SON的背內(nèi)側(cè)、背外側(cè)部,在此處的大細胞分泌OT和VP神經(jīng)元。所以,我們有理由相信ER對OT和VP的調(diào)節(jié)是通過NO來實現(xiàn)的。此外,從雌激素本身的意義來看,女性進入絕經(jīng)期后,伴隨著體內(nèi)雌激素水平的下降,患各種疾病的風(fēng)險增加。絕經(jīng)后女性易患心血管疾病、高血壓、冠心病、骨質(zhì)疏松,以及神經(jīng)退行性疾病等,由此可以看出雌激素對預(yù)防和減少這類疾病的發(fā)生有重要意義。另一方面雌激素在對上述疾病發(fā)揮其保護作用恰恰又是通過NO實現(xiàn)的,