結(jié)核分支桿菌耐藥基因檢測(cè)方法的建立

結(jié)核分支桿菌耐藥基因檢測(cè)方法的建立

本研究在pcr-scp技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了三種檢測(cè)器官植物提取物殘留基因的方法。分析了108例臨床服藥植物的突變，并探討了銀杏根桿菌突變與臨床藥物之間的關(guān)系。材料和方法1.培養(yǎng)基不同梯度藥敏試驗(yàn)108例臨床耐藥株源于我院住院患者痰標(biāo)本,經(jīng)BACTEC-960培養(yǎng)和7H10培養(yǎng)基不同梯度藥敏試驗(yàn)。鏈霉素(SM)、利福平(RFP)、異煙肼(INH)高濃度藥物含量分別依次為4.0,40,400mg/L,低濃度含量分別依次為0.2,0.4,4mg/L,同時(shí)按“結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程”進(jìn)行菌種鑒定。2.試劑結(jié)核分支桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒由本院結(jié)核病分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。7H10培養(yǎng)基由美國(guó)BD公司提供。3.sscp分析痰標(biāo)本經(jīng)前處理后,一部分進(jìn)行藥敏試驗(yàn),另一部分進(jìn)行BACTEC-960培養(yǎng)后,提取DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增:按試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作,擴(kuò)增分支桿菌耐SM基因(rpsL)產(chǎn)生267bp片段,耐RFP基因(rpoB)產(chǎn)生232bp片段,耐INH基因(KatG)產(chǎn)生273bp片段。SSCP分析:將臨床分離株與結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加在同一塊8%(29∶1)非變性聚丙烯酰胺凝膠中,于4℃100~120V電泳6h,銀染色后觀察結(jié)果并照相。結(jié)果判定:雙鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后形成兩條單鏈,經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后呈現(xiàn)兩條單鏈帶。若所呈現(xiàn)的單鏈位置與野生型不同,稱為泳動(dòng)變位,即可判定存在基因突變。結(jié)果1.inh和sm敏感株108例臨床標(biāo)本中,耐株SM98株,其中高濃度耐SM株73株,低濃度耐SM株14株,11株為SM敏感株。耐INH78株,其中高濃度耐INH株64株,低濃度耐INH14株,30株為INH敏感株。108例中耐RFP78株,高濃度耐RFP66株,低濃度耐RFP12株,30株為敏感株。2.臨床菌株sscp分析在108例結(jié)核分支桿菌耐SM、RFP、INH株中,rpsL基因擴(kuò)增均產(chǎn)生267bp片段,rpoB均產(chǎn)生232bp片段,KatG均產(chǎn)生273bp片段。以TB標(biāo)準(zhǔn)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照,98例耐SM分離株中,73例為高耐SM株,63株SSCP分析出現(xiàn)泳動(dòng)變位的rpsL基因突變,14例低耐RFP株中,4株SSCP出現(xiàn)泳動(dòng)變位,SM總突變率為68.5%(67/98)。78例耐RFP株中,64例為高耐RFP株,59株SSCP分析出現(xiàn)泳動(dòng)變位,12例低耐RFP株中,2株SSCP出現(xiàn)泳動(dòng)變位耐RFP總突變率為78.2%(61/78)。78例耐INH株中,64例為高耐INH株,54株SSCP出現(xiàn)泳動(dòng)變位,低耐INH14例中有1株出現(xiàn)泳動(dòng)變位,耐INH總突變率為70.5%(55/78)(表1)。3.108例臨床多耐藥株中,在高濃度有38株3種基因同時(shí)突變,15株為2種基因同時(shí)突變。在低濃度均為單純基因突變,無(wú)2種基因或3種基因同時(shí)突變的現(xiàn)象。sm、rfp、inh基因突變引起耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突變的機(jī)理分別為:RFP抗結(jié)核作用機(jī)制是通過(guò)與結(jié)核分支桿菌RNA聚合酶的β亞單位的結(jié)合,干擾轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始和RNA延伸,編碼β亞單位的基因被命名為rpoB。結(jié)核分支桿菌耐RFP的機(jī)制理論上有兩種可能:一是藥物作用靶分子RNA聚合酶β亞單位的突變;二是細(xì)胞壁滲透性改變導(dǎo)致藥物攝入減少。在試驗(yàn)108例耐藥臨床標(biāo)本中有7例高耐株和10例低耐株未突變,可能是屬于第二種情況,或存在其他耐藥機(jī)制。高耐藥株突變占總突變數(shù)的86.5%,低耐藥株占28.6%。SM主要作用于結(jié)核分支桿菌的核糖體,誘導(dǎo)遺傳密碼的錯(cuò)讀,抑制mRNA轉(zhuǎn)譯的開(kāi)始,干擾轉(zhuǎn)譯過(guò)程中的校對(duì),從而抑制蛋白質(zhì)合成。最近研究認(rèn)為某些菌株耐SM是由于其核糖體S12蛋白編碼基因rpsL或16SrRNA編碼基因rrs突變所致,雖然rrs突變也會(huì)導(dǎo)致部分結(jié)核分支桿菌耐SM,但rpsL突變是SM耐藥的主要分子機(jī)制。本研究顯示,耐SM基因突變株絕大多數(shù)發(fā)生在高耐藥菌株占89.3%,有4例在低耐區(qū)發(fā)生突變,可能因PCR-SSCP實(shí)驗(yàn)敏感,低耐區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)少量高耐藥菌株的基因突變就被檢測(cè)出來(lái),這有待今后研究。異煙肼(INH)是酰肼類化學(xué)合成藥物,結(jié)核分支桿菌對(duì)其高度敏感,但是也易產(chǎn)生耐藥。最近研究表明,結(jié)核分支桿菌耐INH可能與過(guò)氧化氫酶——過(guò)氧化物酶編碼基因KatG和烯?；€原酶編碼基因inhA或烷基過(guò)氧化氫酶編碼基因ahpC改變有關(guān),50%~70%的結(jié)核分支桿菌耐INH分離株KatG有突變,與本研究70.5%相同(表1),其中,高耐藥株有54株,占總突變的84.3%,僅有1株在低耐藥株突變。Zhang等首次從基因水平上對(duì)結(jié)核分支桿菌INH耐藥性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在3株MIC>50μg/ml的高濃度耐藥株中,有2株完全缺失KatG基因,認(rèn)為結(jié)核分支桿菌KatG基因的完全缺失導(dǎo)致了過(guò)氧化氫酶不被表達(dá),從而引起結(jié)核分支桿菌的INH耐藥性。而8株高耐藥株的KatG基因突變,更證實(shí)與INH耐藥性有關(guān)。綜上所述,SM、RFP、INH高、低耐濃度基因突變率,說(shuō)明了耐藥結(jié)核分支桿菌基因突變與傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)有密切聯(lián)系,且耐藥結(jié)核分支桿菌基因突變絕大多數(shù)發(fā)生在高濃度耐藥株,少部分在低濃