國(guó)產(chǎn)氯沙坦鉀片人體生物等效性評(píng)價(jià)

國(guó)產(chǎn)氯沙坦鉀片人體生物等效性評(píng)價(jià)

氯沙坦是一種選擇性、競(jìng)爭(zhēng)于血管緊張素受體的抗劑，它可以阻斷血管緊張素的內(nèi)源性和外源性以及各種藥理作用（包括血管收縮、環(huán)磷酶釋放等）。它可以選擇性地影響at1受體，不影響其他激素受體或血管中重要的離子通道的功能，而是抑制血管緊張素的分解酶（激酶）。它不影響血管緊張素和緩沖液的代謝過(guò)程。其口服吸收后經(jīng)首過(guò)代謝后形成羧酸型活性代謝物及其他無(wú)活性代謝物,生物利用度為25%～35%,消除半衰期在1.5～2h,為一種新型抗高血壓藥物。已報(bào)道的分析方法有:HPLC結(jié)合紫外檢測(cè)法、熒光法等,但這些方法存在一些不足,如靈敏度低,需要血漿樣本量大,相對(duì)復(fù)雜的制備過(guò)程及較長(zhǎng)的分析時(shí)間等。為此,本試驗(yàn)研究以原研制劑科素亞(氯沙坦鉀片)為參比制劑,采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法(HPLC-MS/MS)檢測(cè)中國(guó)健康成年男性志愿者單次空腹口服試驗(yàn)制劑與參比制劑后血漿中氯沙坦原型及其活性代謝產(chǎn)物E-3174的濃度,比較二者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),評(píng)價(jià)試驗(yàn)制劑與參比制劑的生物等效性。1參比制劑r試驗(yàn)制劑(T):氯沙坦鉀片(北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司,規(guī)格:每片50mg,生產(chǎn)批號(hào)090223,有效期為2年)。參比制劑(R):氯沙坦鉀片(科素亞),規(guī)格:每片50mg,生產(chǎn)批號(hào):63-090514,失效期為2011年5月13日,默沙東公司。氯沙坦鉀對(duì)照品(純度>99%,批號(hào):100597-200501,中國(guó)藥品生物制品檢定所);E-3174(純度>99.5%,北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,空白人血漿(吉林大學(xué)第一醫(yī)院)。2analyst1.3數(shù)據(jù)處理軟件環(huán)境API4000型三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子化源以及Analyst1.3數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)AppliedBiosystem公司);Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng),包括二元輸液泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,切換閥(美國(guó)Agilent公司)。3受試者試驗(yàn)前后一般資料本試驗(yàn)篩選并完成20例中國(guó)健康成年男性受試者,年齡為28～36(32.23±2.27)歲,身高162～177(170.95±4.69)cm,體重61.5～80(67.18±6.64)kg,進(jìn)行體格檢查,體重指數(shù)在19～24,無(wú)心、腦、肝、腎、消化、內(nèi)分泌、神經(jīng)精神及過(guò)敏疾病史,無(wú)煙酒嗜好,心電圖、血壓、肝功能、腎功能、HBsAg、抗-HIV、抗-HCV及血常規(guī)、尿常規(guī)檢查均正常,依從性好。試驗(yàn)前2周未服用任何藥物,試驗(yàn)期間禁服其他藥物及煙、酒、茶等,受試者試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)?zāi)康呐c要求充分了解,試驗(yàn)前充分了解試驗(yàn)內(nèi)容與可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)后,自愿簽署知情同意書。試驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。4給藥及隨訪按兩周期交叉自身對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),20名健康成年男性受試者交叉分組,分2次給藥,每次口服氯沙坦鉀片50mg,2次給藥間隔清洗期為1周。受試者于給藥前1日、給藥后1日接受體格檢查、心電圖檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查以評(píng)估用藥安全性,給藥后1日檢查異常者于給藥后7日復(fù)查。試驗(yàn)中在給藥第1日于給藥前0h及給藥后0.25,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10,12,24,36h于上臂肘靜脈各取血一次,每次4mL,肝素抗凝。采集的全血立即置含肝素的抗凝試管中,3000r·min-1離心10min后分離血漿,血漿于-40℃保存待測(cè)。5分析條件5.1%甲醛-3-腈3.ZorbaxSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm),美國(guó)Agilent公司;流動(dòng)相:乙腈-0.1%甲酸(60∶40,v/v);流速:1.0mL·min-1(分流體積比1∶1);柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20μL。5.2解簇電壓dp離子噴霧離子化源;正離子方式檢測(cè);離子噴射電壓:5000V;溫度:450℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力:413.7kPa;氣體2(GS2,N2)壓力:413.7kPa;氣簾氣體(N2)壓力:103.43kPa;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);氯沙坦鉀、E-3174和替米沙坦的解簇電壓(DP)分別為:54、78和96V;碰撞能量(CE)分別為:30、27和60eV;用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z423.2→m/z207.1(氯沙坦)、m/z437.3→m/z207.3(E-3174)和m/z515.2→m/z276.1(替米沙坦)。6lc-ms/ms分析取血漿樣品50μL,依次加入內(nèi)標(biāo)溶液替米沙坦50μL,乙腈350μL,渦流混合1min,離心10min(15000r·min-1),取上層有機(jī)相于試管中,取20μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。7法律研究與評(píng)價(jià)7.1空白血漿樣品的制備分別取6名受試者的空白血漿50μL及一定濃度的氯沙坦和E-3174標(biāo)準(zhǔn)溶液以及內(nèi)標(biāo)替米沙坦溶液加入空白血漿中,進(jìn)樣20μL;取受試者給藥后收集的血漿樣品,依同法操作;考察氯沙坦、E-3174和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的專屬性及特異性。7.2hplc-ms/ms分析取空白血漿50μL,加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50μL;其中氯沙坦和E-3174配制成相當(dāng)于血漿濃度為1、3、10、30、100、300、1000ng·mL-1和3、9、30、90、300、900、3000ng·mL-1的血漿樣品。按“6”項(xiàng)下操作,取20μL進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,記錄色譜圖;以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得的直線回歸方程,即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.3質(zhì)量控制因子按“7.2”項(xiàng)下操作,分別制備氯沙坦和E-3174低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度6樣本,連續(xù)測(cè)定3d。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度,根據(jù)QC樣品結(jié)果計(jì)算本法的準(zhǔn)確度與精密度。7.4質(zhì)量控制qc分別取空白血漿50μL,按“7.2”項(xiàng)下操作,制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(氯沙坦和E-3174濃度分別為3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度4樣本。同時(shí)另取空白血漿50μL,按“7.2”項(xiàng)下操作,向獲得的上層有機(jī)相中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL和內(nèi)標(biāo)溶液50μL,配制成相應(yīng)濃度,渦流混合,取20μL進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,獲得相應(yīng)峰面積,以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。7.5樣品質(zhì)量控制分別取空白血漿50μL,按“7.2”項(xiàng)下操作,制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(氯沙坦和E-3174濃度分別為3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度4樣本。同時(shí)另取水50μL,按“7.2”項(xiàng)下操作,制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(氯沙坦和E-3174濃度分別為3、30、300ng·mL-1和9、90、900ng·mL-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每濃度4樣本。按“7.2”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)峰面積。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示,血漿對(duì)氯沙坦和E-3174無(wú)明顯的基質(zhì)抑制作用,不影響測(cè)定。8數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析ρmax、tmax、AUC0-t、t1/2等主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)由DAS2.1.1統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算處理,以雙單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行生物等效性判定。9結(jié)果9.1固相色譜法確定樣品的專屬性分別取6名受試者的空白血漿50μL,按“7.2”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣20μL,得色譜圖1-A;將一定濃度的氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)替米沙坦溶液加入空白血漿中,依同法操作,得色譜圖1-B;取受試者給藥后收集的血漿樣品,依同法操作,得色譜圖1-C;同法操作考察E-3174和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的專屬性,得圖2。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯沙坦、E-3174、替米沙坦的測(cè)定。9.2檢測(cè)線性范圍和最低檢測(cè)限氯沙坦典型標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0169x+0.000127,相關(guān)系數(shù)r為0.9971,檢測(cè)線性范圍為1～1000ng·mL-1,最低檢測(cè)限為1ng·mL-1;E-3174典型標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.000409x-0.000165,相關(guān)系數(shù)r為0.9974,檢測(cè)線性范圍為3～3000ng·mL-1,最低檢測(cè)限為3ng·mL-1。9.3密度結(jié)果結(jié)果測(cè)定血漿樣品中氯沙坦和E-3174精密度結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,日內(nèi)、日間變異均小于15%,滿足生物等效性研究關(guān)于生物樣本分析檢測(cè)方法學(xué)的技術(shù)要求。9.4市售產(chǎn)品出的中小型或小程序出現(xiàn)的以投資項(xiàng)目為2.2.4%,2.4%;氯沙坦低、中、高3個(gè)濃度回收率分別為(104.9±12.1)%、(104.1±9.8)%、(106.3±2.4)%;E-3174低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度回收率分別為:(100.2±11.1)%、(102.9±10.7)%、(97.7±8.9)%。9.5檢測(cè)中心出,0.3.3.3.3.3.3.38.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8.8%氯沙坦低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為(108.0±11.9)%、(98.6±9.3)%、(98.3±8.8)%;E-3174低、中、高3個(gè)濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為(103.4±11.5)%、(100.6±13.0)%、(94.1±11.3)%。9.62氯沙坦?jié)舛鹊臏y(cè)定20名健康受試者按隨機(jī)分組、自身前后對(duì)照設(shè)計(jì),分別口服氯沙坦鉀片試驗(yàn)制劑和參比制劑50mg后,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測(cè)定血漿中氯沙坦?jié)舛取?0名健康受試者服藥后血漿中相應(yīng)的氯沙坦原型及代謝產(chǎn)物E-3174的平均血藥濃度(ρ)-時(shí)間(t)曲線見(jiàn)圖3。9.7e-1334的表觀濃度及藥代動(dòng)力學(xué)利用DAS2.1.1軟件對(duì)20名健康受試者給予試驗(yàn)制劑和參比制劑后血漿中相應(yīng)的氯沙坦原型及代謝產(chǎn)物E-3174的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下:試驗(yàn)制劑和參比制劑中相應(yīng)的原型藥物的血藥峰濃度ρmax分別為(207.50±68.14)、(187.23±89.92)μg·L-1;達(dá)峰時(shí)間tmax分別為(1.69±1.70)、(1.53±0.76)h;濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-12h)分別為(457.79±126.46)、(442.08±137.48)μg·h·L-1;末端消除半衰期(t1/2)分別為(2.09±0.59)、(2.01±0.33)h;表觀分布容積(V/F)分別為(346.23±137.63)、(342.11±92.52)L;血漿藥物清除率(CL/F)分別為(115.19±35.06)、(118.84±31.89)L·h-1。代謝產(chǎn)物E-3174的血藥峰濃度ρmax分別為(642.05±280.08)、(659.91±295.72)μg·L-1;達(dá)峰時(shí)間tmax分別為(4.10±1.86)、(4.23±1.69)h;濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-36h)分別為(4702.39±1803.18)、(4703.28±1959.33)μg·h·L-1;末端消除半衰期(t1/2)分別為(4.82±0.84)、(5.13±1.94)h;表觀分布容積(V/F)分別為(96.72±72.66)、(126.41±182.24)L;血漿藥物清除率(CL/F)分別為(15.71±18.98)、(14.65±12.47)L·h-1。9.8氯沙坦鉀片的生物利用度將氯沙坦鉀片試驗(yàn)制劑與參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-t(經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)、ρmax(經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)、tmax實(shí)測(cè)值采用孫瑞元教授編寫的DAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2～4。研究表明,口服氯沙坦鉀片個(gè)體間差異較大。雙向單側(cè)t檢驗(yàn)表明,氯沙坦AUC0-12h的[1-2α]置信區(qū)間為99.8%～121.9%,在80%～125%之間,試驗(yàn)制劑對(duì)參比制劑的相對(duì)生物利用度為110.3%。氯沙坦ρmax的[1-2α]置信區(qū)間為101.0%～127.0%,在70%～143%之間。結(jié)果表明,氯沙坦鉀片試驗(yàn)制劑與參比制劑中氯沙坦的AUC0-t、ρmax、tmax均符合SFDA對(duì)生物等效性要求,故判定氯沙坦鉀片試驗(yàn)制劑和參比制劑生物等效。