基于es-ssr位點(diǎn)的鵝掌楸家系子代種屬分析效率比較

基于es-ssr位點(diǎn)的鵝掌楸家系子代種屬分析效率比較

通過遺傳標(biāo)記研究個(gè)體和群體之間的關(guān)系，重建后代親屬譜系，并進(jìn)行觀察和分析。親本分析主要有單親分析和雙親分析兩種,而單親分析中父本分析方式較常見。親本分析的理論模型主要有3類:即遺傳排除法(Geneticexclusion)、最大似然法(Maximumlikelihoodassignment)和父性拆分法(Fractionpaternityassignment),基于最大似然法開發(fā)的親本分析軟件CERVUS應(yīng)用最為廣泛(Kalinowskietal.,2007;Jonesetal.,2010;Xuetal.,2010)。目前,親本分析軟件在動(dòng)植物研究中應(yīng)用較為廣泛,但在具體選擇哪一種分析軟件時(shí),還應(yīng)考慮試驗(yàn)群體類型、遺傳標(biāo)記種類及特點(diǎn)、潛在親本數(shù)量、突變率,零等位基因頻率、以及讀帶誤差等等,上述因素均會(huì)影響親本分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而,迄今為止,對(duì)于不同親本分析軟件效率的比較研究尚未見報(bào)道,僅Slate等(2000)利用麋鹿(Cervuselaphus)為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)CERVUS軟件親本分析的準(zhǔn)確性進(jìn)行過討論?；诖?本研究以譜系清楚的90個(gè)鵝掌楸控制授粉子代及其278個(gè)候選親本為實(shí)驗(yàn)材料,在假定父本未知或雙親未知的條件下,采用三種親本分析軟件(CERVUS,COLONY和PAPA)對(duì)鵝掌楸子代及候選親本進(jìn)行親本分析,將分析所得結(jié)果與子代的真實(shí)親本進(jìn)行對(duì)比,進(jìn)而比較3種軟件的效率及特點(diǎn),期望為植物親本分析軟件的選擇提供參考。1結(jié)果與分析1.1ssr位點(diǎn)基因特征利用13對(duì)SSR引物對(duì)鵝掌楸實(shí)驗(yàn)群體(90個(gè)已知親本的子代及278個(gè)候選親本)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)群體中,13對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出68個(gè)等位基因,每個(gè)位點(diǎn)的等位基因平均數(shù)為5.23(表1)。13個(gè)SSR位點(diǎn)的平均觀測雜合度為0.4766。Shannon多樣性指數(shù)在不同位點(diǎn)間差異較大,其中,位點(diǎn)LT91最高,為1.929;而位點(diǎn)LT98最低,僅為0.6781,平均為1.4636。表明該批SSR引物具有較高的多態(tài)性,適合用于親本分析。利用CERVUS3.0軟件分析了13個(gè)SSR位點(diǎn)的零等位基因頻率。零等位基因頻率變動(dòng)范圍為0.1398~0.4177,平均為0.219。1.2更新苗木的親水性利用三種親本分析軟件分別對(duì)雙親已知的控制授粉子代(即譜系清楚子代)及雙親均未知的林下自然更新苗木(即譜系不清的子代)進(jìn)行雙親分析(表2)。可以看出,三種軟件對(duì)譜系清楚的控制授粉子代的檢出比例均高于譜系不清的林下自然更新子代的檢出比例。相比較而言,PAPA與COLONY兩種軟件的分析效率較高,且兩者效率幾乎相同,而CERVUS軟件的分析效率明顯低于上述兩者。1.3年生虎產(chǎn)品親本分析以278個(gè)鵝掌楸成年個(gè)體作為候選親本群體,在設(shè)定候選親本取樣比例為1,平均基因分型誤差為0.01,似然計(jì)算誤差為0.01的條件下,利用CERVUS3.0、COLONY和PAPA三種軟件對(duì)90個(gè)鵝掌楸控制授粉子代進(jìn)行親本分析。表3為80%置信度下的親本推定結(jié)果。從中可以看出,COLONY軟件的親本分析效率較高。除了雙親分析中推定親本準(zhǔn)確率為37.78%,稍低于CERVUS3.0分析43.5%外,COLONY軟件分析的結(jié)果均高于另外兩種軟件。與CERVUS3.0、COLONY兩種軟件分析結(jié)果相比,PA-PA2.0分析結(jié)果準(zhǔn)確性較低。同時(shí),還可以看出,對(duì)于同一種軟件而言,其單親分析(如父本分析)準(zhǔn)確率均高于雙親分析。1.4cervus軟件分析結(jié)果以鵝掌楸控制授粉子代及所有潛在親本為實(shí)驗(yàn)材料,比較三種親本分析軟件在兩種交配類型(自交,異交)子代群體中的的親本分析效率(表4;表5)。結(jié)果顯示,PAPA與COLONY兩種軟件在不同交配類型子代的父本分析結(jié)果相差不大,而CERVUS軟件分析結(jié)果則差異較大。父本分析時(shí),CERVUS對(duì)于自交子代分析結(jié)果較差,不能正確檢驗(yàn)出兩個(gè)親本,但對(duì)于異交子代則分析結(jié)果較好,在80%置信度下其推定比例,其檢出比例及推定親本準(zhǔn)確率分別為70.8%和86.3%(表4)。而雙親分析時(shí),COLONY和CERVUS對(duì)異交子代分析結(jié)果較差,但對(duì)自交類型分析結(jié)果較好,自交類型中CERVUS分析得到的推定親本準(zhǔn)確率為81.2%,COLONY軟件推定親本準(zhǔn)確率為83.3%(表5)。與其他兩個(gè)軟件相比,PAPA2.0的分析結(jié)果則正好相反?？梢?PAPA軟件適用于異交子代的親本分析,而COLONY和CERVUS軟件適用于自交子代的親本分析。2不同種類林木親本分析本研究所比較的三種軟件(COLONY,CERVUS和PAPA)中,CERVUS應(yīng)用范圍最廣,而PAPA應(yīng)用較少(Duchesneetal.,2002)。相比較而言,COLONY軟件的功能較多。該軟件不僅可用于親本分析,而且還可用于譜系構(gòu)建,分析群體的交配系統(tǒng)類型及個(gè)體的繁殖適合度,以及重構(gòu)親本或子代的基因型(Wang,2007)。CERVUS軟件最早應(yīng)用于動(dòng)物的親本分析。隨著林木分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用,該軟件也逐漸應(yīng)用于林木的父本分析。目前,CERVUS已應(yīng)用于歐洲冷杉(Abiesalba)(Vendraminetal.,1999)、馬尾松(Pinusmassoniana)(艾暢等,2006)、青岡(Cyclobalanopsisglauca)(陳小勇和宋永昌,2000)、櫟樹(Quercusmacrcarpa)(DowandAshley,1996)、黑楊(PopulusnigraL.)(Georgetal.,2010)、鵝掌楸(Liriodendron)(Xuetal.,2006)等樹種的父本分析。Slate等(2000)在馬鹿(Cervuselaphus)的父本分析中,僅對(duì)CERVUS軟件的準(zhǔn)確性進(jìn)行了研究。Slate等(2000)利用84個(gè)位點(diǎn)對(duì)已知子代的172個(gè)候選父本進(jìn)行分析,在80%置信度下其父本推定比率為98.25%,推定親本中真正親本比例為75.1%。本文利用13個(gè)SSR位點(diǎn)對(duì)鵝掌楸90個(gè)控制授粉子代進(jìn)行父本分析,與Slate等(2000)相比,所使用的標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)大大減少,但親本分析效率僅稍低于Slate等(2000)結(jié)果。在80%,置信條件下,利用CERVUS軟件檢出親本的子代比率為70.%,推定父本準(zhǔn)確率為69.9%(表3)。表明對(duì)于異交為主的林木,在進(jìn)行親本分析時(shí),采用10~20個(gè)多態(tài)性較高的共顯性分子標(biāo)記(如SSR)就能達(dá)到較高的親本分析效率,從而可大大降低實(shí)驗(yàn)工作量。而如果采用不同的親本分析軟件對(duì)相同實(shí)驗(yàn)群體采用相同的標(biāo)記類型與數(shù)量,其結(jié)果又如何?本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,COLONY軟件的分析效率優(yōu)于CERVUS軟件,而PAPA分析結(jié)果則相對(duì)較差。這足以說明親本分析時(shí)軟件選擇的重要性。三種軟件的雙親分析效率均低于單親分析(父本分析)。究其原因,可能有以下三個(gè)方面:(1)鵝掌楸為兩性花,其交配類型主要以異交為主,兼性自交。與動(dòng)物中單性異交的交配方式相比,林木的交配系統(tǒng)更復(fù)雜,增加了親本分析的難度,尤其是雙親分析(JonesandArdren,2003)。(2)本研究所選用的13個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的零等位基因頻率較高。親本分析時(shí),如果所采用標(biāo)記位點(diǎn)的零等位基因頻率較高,將導(dǎo)致某些真正的親本被錯(cuò)誤排除,導(dǎo)致親本分析的準(zhǔn)確性降低。許多親本分析軟件試圖通過特定的算法來降低零等位基因?qū)τH本分析的影響,但效果并不太理想(DakinandAvise,2004;JonesandArdren,2003)。(3)本研究僅選用了13個(gè)SSR位點(diǎn),位點(diǎn)數(shù)稍少,有可能導(dǎo)致親本排除概率不足。如果增加分子標(biāo)記數(shù)量,或可提高雙親分析效率(Jonesetal.,2010)。綜上所述,對(duì)于以異交為主兼性自交的森林樹種如鵝掌楸,在單親(比如,父本)分析時(shí),采用CERVUS及COLONY軟件分析效果較好。而雙親分析時(shí),盡管3種軟件的分析結(jié)果都不甚理想,但相比較而言,CERVUS及COLONY軟件適用于自交子代的親本分析,而PAPA軟件適用于異交子代的雙親分析。本研究結(jié)果對(duì)于植物親本分析軟件的選擇具有參考意義。3材料和方法3.1不同來源、不同采種引物、苗的出現(xiàn)和配為比較不同親本分析軟件的效率,利用已有的鵝掌楸雜交育種親本群體及控制授粉子代群體,以及林下自然更新子代苗木作為本研究的實(shí)驗(yàn)群體。親本群體來自1994年建立的鵝掌楸屬(Liriodendron)種源試驗(yàn)林(李火根等,2005)?？刂剖诜圩哟后w來源于2005年所獲得的控制授粉子代,詳細(xì)的交配組合見表6。2005年10月采種,共獲得15個(gè)交配組合子代種子。2006年3月播種育苗,2008年春定植于江蘇省句容市下蜀鎮(zhèn)南京林業(yè)大學(xué)實(shí)習(xí)林場。2011年7月中旬,從每個(gè)交配組合的子代中(全同胞家系)隨機(jī)選取6個(gè)個(gè)體(基因型),每個(gè)個(gè)體采集3~5片嫩葉,置于-70℃超低溫冰箱內(nèi)保存。同年8月,在親本群體(種源試驗(yàn)林)內(nèi)設(shè)定16m×16m樣方,采集樣方內(nèi)所有林下自然更新小苗幼嫩葉片,共獲115株子代苗。同時(shí),采集所有潛在親本(278株)的幼嫩葉片,置于-70℃超低溫冰箱內(nèi)保存。3.2學(xué)習(xí)方法3.2.1博等人的《博等》采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法(張博等2004;Kasemetal.,2008)提取鵝掌楸基因組DNA,利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測。3.2.2pcr擴(kuò)增體系及程序從Xu等(2006)開發(fā)的176對(duì)EST-SSR引物中篩選出13對(duì)多態(tài)性引物對(duì)鵝掌楸實(shí)驗(yàn)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序分別列于表7和表8。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4μL溴酚藍(lán),采用8%聚丙烯酰胺變性凝膠進(jìn)行電泳。經(jīng)硝酸銀染色顯帶,最后,利用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行判讀。3.2.3推定親本的子代比例及準(zhǔn)確度o)、Shannon多樣性指數(shù)(I)和零等位基因頻率(nullallelefrequence),同時(shí)利用CERVU-S3.0,COLONY2.0和PAPA2.0對(duì)子代進(jìn)行父本分析及雙親分析。CERVUS3.0及COLONY2.0在80%的置信概率條件下計(jì)算推定親本的子代比例及推定親本準(zhǔn)確率,具體的計(jì)算公式(Slateet