高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大鼠灌胃給藥的生物利用度

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大鼠灌胃給藥的生物利用度

延續(xù)是中國傳統(tǒng)的中藥，來自四川連續(xù)植物的延續(xù)（c.y.cheng等t.m.ai）?？勺鳛檫B續(xù)藥物的主要活性成分，連續(xù)甾醇d含量最高。進一步提取甾醇具有促進成骨細胞復(fù)制和分化的作用?？诜锸褂寐实停P(guān)于藥物代動力學(xué)的報道也很少。在文獻中，沒有關(guān)于動物飼料的絕對生物利用度的文章。在這項工作中，使用高效液相鉻聯(lián)合使用方法（lc-ms-ms）確定大鼠血漿中藥物濃度，并檢測插入小鼠胃的絕對生物利用度。1儀器和試劑盒1.1高效液相色譜3200QTRAP型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst1.5數(shù)據(jù)處理軟件（美國AppliedBiosystem公司）；Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元輸液泵、自動進樣器、切換閥（美國Agilent公司）；Eppendorf離心機（Eppendorf5415D，德國）；YKH-型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）1.2替米沙坦對照品，初創(chuàng)期生產(chǎn)木通皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111685-20103，純度：93.5%，中國藥品生物制品檢定所）；內(nèi)標(biāo)替米沙坦對照品（Sigma公司，批號074K47102，含量大于99.0%）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純．1.3動物雄性SD大鼠，質(zhì)量：（200±20)g（北京大學(xué)動物部）．2方法和結(jié)果2.1流動相aglent色譜柱：XDB-C18柱（5μm,150mm×4.6mm，美國Agilent公司）；流動相：5mmol·L-1乙酸銨含φ=0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（見表1）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：35℃；進樣量：20μL.2.2木通皂苷定量離子對質(zhì)荷比的影響離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；檢測方式：正離子檢測方式；離子噴射電壓：5500V；源內(nèi)氣體1(GS1,N2）壓力：345kPa；源內(nèi)氣體2(GS2,N2）壓力：379kPa；氣簾氣體壓力：138kPa；離子源溫度：550℃；木通皂苷定量離子對質(zhì)荷比（A/Z):946.4→455.3(DP電壓：80V;CE電壓：35eV）；內(nèi)標(biāo)替米沙坦定量離子對（A/Z):515.1→276.1(DP電壓：35V;CE電壓：50eV）．相應(yīng)的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1.2.3替米沙坦儲備液的配制精密稱取10mg木通皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成100μg·mL-1的儲備液．2）內(nèi)標(biāo)溶液精密稱取10mg替米沙坦對照品，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成100μg·mL-1的儲備液，取適量替米沙坦儲備液用甲醇稀釋至100ng·mL-1.2.4lc-ms/ms分析精密量取血漿樣品50μL置于1.5mLEP管中，分別加入50μL100ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液和50μL甲醇溶液，渦旋1min后16100g離心5min，取上清液進行LC-MS/MS分析，進樣量為20μL.2.5理論與實踐的確認2.5.1專業(yè)取空白大鼠血漿樣本50μL、大鼠給藥后收集的血漿樣品，按“2.4”項下操作．結(jié)果表明：內(nèi)源性物質(zhì)不干擾木通皂苷D和替米沙坦的測定.2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立分別取木通皂苷D儲備液適量，用甲醇稀釋，配制0、10、30、100、200、500、1000ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別加入空白大鼠血漿溶液和內(nèi)標(biāo)100ng·mL-1替米沙坦溶液各50μL，按“2.4”項下進行渦旋、離心處理，取上清20μL在LC-MS/MS中進樣．以標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的實測峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對標(biāo)示濃度（X）進行加權(quán)最小二乘法（1/χ2）線性回歸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為2.5.3準(zhǔn)確度和精密度按“2.5.2”項下操作，制備木通皂苷D低、中、高3個質(zhì)量濃度（分別為30、100、800ng·mL-1）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個質(zhì)量濃度6個樣本，根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計算QC樣品的測得質(zhì)量濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見表2.2.5.4提取回收率取空白血漿50μL，制備低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣本，每個質(zhì)量濃度3個樣本；同時另取空白血漿50μL，經(jīng)甲醇沉淀蛋白后將上清液40℃下氮氣吹干，加入50μL蒸餾水，再加入相應(yīng)濃度的質(zhì)控和內(nèi)標(biāo)溶液，處理后進行LC-MS/MS分析，獲得回收率樣本相應(yīng)峰面積，提取回收率為質(zhì)控樣本峰面積與回收率樣本峰面積之比；以蒸餾水代替空白血漿，按回收率樣本前處理方法進行樣本前處理，進行LC-MS/MS分析，獲得基質(zhì)效應(yīng)樣本相應(yīng)峰面積，基質(zhì)效應(yīng)為回收率樣本峰面積與基質(zhì)效應(yīng)樣本峰面積之比與1的差．木通皂苷D低、中、高3個質(zhì)量濃度提取回收率分別為（108.1±9.5)%,(95.3±9.9)%,(103.6±8.6）%，內(nèi)標(biāo)替米沙坦提取回收率為（96.5±3.2）%．木通皂苷D和內(nèi)標(biāo)替米沙坦低、中、高3個質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為-8.57%、-1.96%、-3.63%，內(nèi)標(biāo)替米沙坦的基質(zhì)效應(yīng)為-2.38%．結(jié)果顯示：血樣中木通皂苷D和內(nèi)標(biāo)替米沙坦提取回收率均較高且穩(wěn)定，血樣中基質(zhì)對木通皂苷D和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的基質(zhì)效應(yīng)較小，均不影響準(zhǔn)確測定．2.6木通肥皂d大鼠腹腔給藥血漿中藥物質(zhì)量濃度的測定2.6.1血藥濃度測定取雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為2組，每組6只大鼠，分別口服灌胃和靜脈注射給予木通皂苷D水溶液，給藥劑量為100mg·kg-1，口服組于20、40min、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h眼眶取靜脈血，靜脈注射組于5、10、20、30min、1、2、4、6、12、24h眼眶取靜脈血，每次取血約0.5mL置于肝素化EP管中，5900g離心10min，取上清血漿樣本50μL，按“2.4”項下處理，取上清20μL在LC-MS/MS中進樣．將實測峰值面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算血藥濃度，平均血藥濃度-時間曲線見圖2，其中口服組12h后血藥濃度低于最低定量限．2.6.2木通皂苷d水溶液大鼠灌胃生物利用度數(shù)據(jù)處理采用生物利用度研究數(shù)據(jù)處理通用程序（簡稱BAPP2.0，由中國藥科大學(xué)藥代中心提供）計算藥時曲線下面積AUC0-t和AUC0-INF,tmax和ρmax采用實測值．口服生物利用度（f）為口服組AUC0-INF與靜脈組AUC0-INF之比．結(jié)果見表3．結(jié)果表明木通皂苷D水溶液大鼠灌胃給藥的f很低，僅為0.13%.3灌胃給藥后的生物利用度檢測木通皂苷D為皂苷類化合物，大鼠口服灌胃給藥后f很低，很難用高效液相紫外檢測（LC-UV）的方法進行體內(nèi)血漿樣本的分析．LC-MS/MS與之相比具有明顯的優(yōu)越性，檢測靈敏度高、專屬性強、需用血漿量較少，為木通皂苷D的臨床前研究提供了穩(wěn)定可靠而又方便易行的檢測手段．Li等報道了LC-MS/MS法檢測血漿樣本中木通皂苷D濃度的方法，并檢測了木通皂苷D大鼠灌胃給藥后的不同時間點血藥濃度，但未檢測其注射給藥后的血藥濃度，因此未能計算灌胃給藥的絕對生物利用度．本研究給藥劑量和灌胃給藥取血時間點與Li等報道的相同，但結(jié)果不完全一致．文獻報道木通皂苷D的tmax為1.2h，而本研究發(fā)現(xiàn)木通皂苷D灌胃給藥未見明顯吸收峰，可能是由于其f非常低，而在小腸上段吸收較多有關(guān)．我們?yōu)榱颂岣吖辔附o藥的f，在后續(xù)的試驗中加入了一定濃度的吸收促進劑進行相關(guān)試驗，所得的結(jié)果也驗證了這一趨勢，即10～20min血藥濃度即達到峰值，后面的時間點未見明