花梨木改善小鼠抑郁樣行為的機制研究

花梨木改善小鼠抑郁樣行為的機制研究

隨著現代計算機科學的發(fā)展，經絡感知通道已成為控制和預防神經疾病的新目標通道，對患有抑郁、精神分裂癥、老年輕視和其他疾病有良好的預防和效果。目前抑郁癥的治療主要是5-羥色胺再攝取抑制劑,但藥物不良反應大,患者長期應用會產生耐受等問題。本實驗室前期的研究表明,某些芳香物質如香草醛及丁香酚可以通過嗅覺通路作用于大腦相關區(qū)域,改善記憶功能;另有文獻報道,某些芳香物質可以通過嗅覺通路改善抑郁癥狀,但機制不詳。本研究在此采用慢性不可預知性中等強度刺激(CUMS)動物模型并結合芳香物質花梨木精油通過嗅覺通路吸嗅給藥的方法來觀察抑郁小鼠神經行為學的改變,并用形態(tài)學的方法探討其可能的機制,增加對抑郁癥發(fā)生的認識和理解。材料和方法一、實驗動物及設備48只健康C57BL/6小鼠,雄性,每組12只,體重15-25g,2個月齡(購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)。電子天平,JA21001型9(上海精科天平廠);懸尾實驗,仿文獻自制;強迫游泳實驗,仿文獻自制;Leica石蠟切片機,RM2135型(德國);切片漂烘溫控儀,QP-B型(安徽電力科學研究所);攝片顯微鏡,Nikon80i型(日本)。二、方法1.抑郁癥模型的制作48只C57BL/6小鼠置于安靜、室溫(25±1)℃、自然光照的實驗室中單籠飼養(yǎng),自由飲水及攝食,飼養(yǎng)1周。參照文獻采用CUMS+孤養(yǎng)方法制作抑郁癥模型。以下刺激方式以每天1次的頻率隨機交替小鼠應激21d,應激源包括:禁食24h,禁水24h,45℃熱刺激3min,4℃冷刺激3min,懸吊15min,夾尾90s,晝夜顛倒24h。建模成功的標準:經過3周CUMS之后,小鼠的懸尾實驗、強迫游泳實驗的不動時間顯著高于應激前,24h糖水消耗量顯著低于應激前,剔除應激前后數值變化低于總數均數10%的小鼠。2.抑郁癥狀的測定將48只小鼠隨機均分為對照組、CUMS組、CUMS+花梨木精油吸嗅組(花梨木組)、CUMS+鹽酸氟西汀組(百憂解組)。花梨木組給予花梨木精油吸嗅,吸嗅方法參考文獻,百憂解組用百憂解灌胃,按3.33mg·kg-1·d-1給藥。在吸嗅2、3、4周時間點分別進行抑郁癥獲得性無助行為評分,以了解抑郁癥緩解情況。在獲得性無助行為緩解之后對實驗動物進行24h糖水消耗量測定,以綜合評價抑郁癥的緩解情況。3.神經學(1)樹脂玻璃箱的配制動物尾部遠端1.5cm處固定后懸掛于40cm×40cm×40cm的白色樹脂玻璃箱中,距地面15cm。記錄6min內的第2-6分鐘的不動時間總和。(2)強制游泳實驗參考Porsolt等方法,記錄6min內的第2-6分鐘的不動時間總和。(3)24小時糖消費實驗將每只小鼠的飲水瓶內加入1%的蔗糖溶液100ml,同時進行禁食,計算小鼠在24h內飲用1%的蔗糖溶液量。4.層面切片片型行為學檢測結束后處死動物,4%多聚甲醛灌注固定,取腦組織,石蠟包埋,連續(xù)冠狀層面切片,片厚5μm。切片脫蠟,水化,免疫組化SABC法染色,0.01M檸檬酸鹽緩沖液微波修復抗原,一抗為單克隆兔抗小鼠多巴胺2型受體(DAR2),二抗為生物素標記山羊抗兔IgG,顯微鏡下觀察多巴胺(DA)表達情況,并采集圖像。三、方差分析方法采用SPSS13.0軟件包進行統計分析,計量數據用均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。進一步進行組間兩兩比較時,若方差齊時,采用SNK檢驗;若方差不齊,采用Games-Howell檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。結果一、小鼠在吸嗅治療2、3和4周時懸尾的靜力與CUMS組比較,花梨木組和百憂解組小鼠在吸嗅治療2、3和4周時的懸尾安靜和強迫游泳時間均明顯縮短,而糖水消耗量明顯增加(P<0.05)(表1-3)。二、小鼠杏仁核、海馬、瞳仁斷、未固結反應內da的表達免疫組化結果經圖像分析與統計學處理顯示,與CUMS組相比,花梨木組與百憂解組小鼠的杏仁核(見封二圖1)、海馬(見封二圖2)、下丘腦(見封二圖3)內DA的表達明顯升高。抑郁癥患者花梨木精油的作用嗅覺與抑郁癥關系密切,嗅覺與情緒也有聯系,嗅覺中樞如下丘腦、海馬、杏仁核與抑郁癥關系密切,參與抑郁癥的發(fā)生、病理過程。芳香物質丁香酚可以通過與鼻腔黏膜的嗅上皮上存在的特異性嗅覺受體神經元(ORN)上特異性G蛋白偶聯受體相結合,通過環(huán)磷酸腺苷激活ORN上的離子通道,從而產生嗅覺感受器電位,這個電位可通過ORN的軸突傳遞至嗅球中特異性的嗅小球,而嗅小球可通過僧帽細胞與簇細胞的二級軸突形成的嗅覺通路到達腦的特異性腦區(qū),如嗅前核、下丘腦、梨狀前皮質、杏仁核、內側嗅皮質、海馬。本研究行為學結果顯示,花梨木精油吸嗅能夠緩解小鼠的抑郁樣行為,表明花梨木精油干預的有效性?；ɡ婺揪陀墟?zhèn)靜、收斂、穩(wěn)定的特性,可以鎮(zhèn)定中樞神經系統,緩解抑郁。免疫組化結果顯示,花梨木組和百憂解組在杏仁核區(qū)產物較多,推測杏仁核參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。國外研究表明,杏仁核是控制情感最重要的腦區(qū),但其中樞的機制還不很清楚。杏仁核在多巴胺能系統活動中起到主要的作用,而情緒的調節(jié)與多巴胺能系統有直接的聯系。研究表明,杏仁核和額皮質能夠調節(jié)情感過程,由此表明,杏仁核能夠介導多巴胺能神經遞質的傳遞。神經影像學的研究論證了杏仁核在情感記憶中發(fā)揮了重要的作用,杏仁核可以直接調節(jié)情緒記憶或者通過海馬的調制來實現。免疫組化結果顯示,在海馬和下丘腦區(qū)花梨木組也較對照組多,海馬與學習記憶有關。抑郁癥可以引起動物行為學的異常、神經遞質的變化、免疫系統和內分泌系統的改變。抑郁癥發(fā)病機制主要是單胺學說,DA、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素與抑郁癥關系密切。DA能夠調節(jié)人類杏仁核和前額皮質的活動,臨床研究表明,抑郁癥患者的腦內DA、5-HT等含量減少,這與本研究免疫組化結果相一致。本研究利用芳香物質通過吸嗅的方式到達嗅球,再到達嗅覺