生殖不全鰓氏桿菌mis的分子作用和臨床應(yīng)用

生殖不全鰓氏桿菌mis的分子作用和臨床應(yīng)用

如果男性胚胎的腎臟導(dǎo)管通過雄激素的作用分為輸精管和附件管，則另一種生殖管和幼苗導(dǎo)管會逐漸退化。原因為睪丸Sertoli細胞分泌一種稱為MIS(mullerianinhibitingsubstance)的物質(zhì)。近年來有人已對MIS進行提純、克隆、基因定位,并發(fā)現(xiàn)MIS除抑制苗勒管分化外尚有其他一些作用,現(xiàn)就MIS的分子生物學(xué)、作用和臨床應(yīng)用綜述如下。MIS的分子生物學(xué)一、胎血運物質(zhì)變化最初有人發(fā)現(xiàn)在牛的雌雄同體胚胎中雌胎缺乏苗勒管衍生物,原因為雌雄胎兒共用一個胎盤以致雌胎受到來自雄胎血運物質(zhì)的影響,稱為生殖不全牝犢現(xiàn)象(freemartinphenomenon)。50年前Jost發(fā)現(xiàn)胚胎睪丸能分泌一種不同于睪酮并能使苗勒管退化的物質(zhì)。1969年P(guān)icon報告尚未出現(xiàn)性分化的大鼠胚胎苗勒管對不同物種的MIS均起反應(yīng)。以此為基礎(chǔ),研究人員首先對牛的MIS蛋白進行提純。二、mis基因啟動子分析MIS被認為是β-轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)家族成員之一。牛的MIS蛋白由575個氨基酸構(gòu)成,人的MIS蛋白則有560個氨基酸。MIS的羧基端同TGF-β家族其他成員結(jié)構(gòu)上呈明顯的同源性。牛的MIScDNA首先被克隆,然后分別得到人類基因組克隆和大鼠、小鼠的MIScDNA。人的MIS基因已定位于19號染色體p13.2～13.3,而小鼠的MIS基因定位于10號染色體遠端區(qū)域。對MIS基因分析發(fā)現(xiàn)MIS基因較短,約4000個堿基;外顯子由2000個堿基構(gòu)成,其中第5外顯子在物種間同源性最高并且是MIS基因中唯一對TGF-β家族顯示同源性的部分。精確和有效的轉(zhuǎn)錄需要啟動子。牛的MIS基因啟動子含有一個典型的TATA盒結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄起始點位于編碼絲氨酸的ATG密碼子上游10個堿基對處。大鼠和小鼠亦有典型的TATA盒結(jié)構(gòu)。但人的MIS基因只有退化的TTAA結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄起始點也不只一個。Shen等對MIS基因啟動子進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIS基因的調(diào)節(jié)要素位于其5′側(cè)約180個堿基對區(qū)域,又稱啟動子區(qū)域。對這個區(qū)域DNA順序研究發(fā)現(xiàn),它可以和多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并對MIS基因轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控。三、mis基因同資源性產(chǎn)物的共通性和轉(zhuǎn)導(dǎo)性因子的選擇一個單因素的結(jié)合區(qū)嚙齒動物MIS在Sertoli細胞中表達晚于SRY1d,而在人類其表達則在孕期第7周時稍晚于SRY表達。SRY基因是形成睪丸的一個關(guān)鍵基因。MIS和SRY的組織特異性以及互補的個體發(fā)育特性提示SRY可能誘導(dǎo)MIS轉(zhuǎn)錄。Shen等發(fā)現(xiàn)MIS基因的啟動子上有一個保守區(qū)和SRY結(jié)合。采用DNase和膠移位(gelshift)方法確定含有GTTTGT的-63～-49區(qū)和SRY的DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合。這個特定區(qū)域內(nèi)的突變?nèi)琰c突變或整個區(qū)域去除均不能減弱MIS的轉(zhuǎn)錄,表明SRY對MIS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是間接的,需要SRY協(xié)同因子的存在來實現(xiàn)特異地激活這個結(jié)合區(qū)。如同類固醇源性因子-1(SF-1)一樣,SRY的表達也有組織特異性。有人發(fā)現(xiàn)SF-1控制MIS基因表達的主要調(diào)節(jié)要素區(qū)位于-180～-65堿基對之間。內(nèi)含兩個高度保守的要素分別被命名為MIS-RE-1和MIS-RE-2。MIS-RE-1包括20個堿基對區(qū)(-83～-104),這個區(qū)域內(nèi)AGGTCA順序和一些核內(nèi)受體DNA結(jié)合區(qū)內(nèi)的DNA順序相匹配。研究人員首先利用膠移位法排除MIS-RE-1和SRY結(jié)合的可能,然后根據(jù)結(jié)合區(qū)域能和核內(nèi)受體家族成員結(jié)合的特點,最終確定SF-1為MIS-RE-1的結(jié)合蛋白。對MIS-RE-1位點突變研究,觀察到破壞此區(qū)域在Sertoli細胞系和轉(zhuǎn)基因小鼠中明顯地減弱MIS基因的轉(zhuǎn)錄活性。另外,實驗證實在胚胎發(fā)育期間SF-1和MIS基因在Sertol細胞的表達,且SF-1是MIS基因表達的主要調(diào)節(jié)因子。在組織特異性方面發(fā)現(xiàn)SF-1只在鼠胚胎睪丸有結(jié)合MIS-RE-1的活性,提示原始Sertoli細胞能提供MIS基因表達所需的附加因子,如SF-1協(xié)同激活因子,提示SF-1具有組織特異性。在生物體及小鼠的生殖嵴中,SF-1的表達早于MIS,從時間上佐證了SF-1對MIS的調(diào)節(jié)作用。作為轉(zhuǎn)錄因子GATA家族的DNA結(jié)合順序也在MIS基因啟動子區(qū)域中被發(fā)現(xiàn),在Sertoli細胞中表達的GATA1未見有激活MIS啟動子的能力。而GATA4則被發(fā)現(xiàn)不僅有MIS基因調(diào)節(jié)的功能,更有和SF-1協(xié)同的作用,由于GATA因子和SF-1因子在MIS啟動子區(qū)域結(jié)合位點相鄰,所以很可能這兩個因子在MIS的表達上有轉(zhuǎn)錄協(xié)同作用。GATA因子除了GATA4外,是否還有其他GATA因子參與需進一步研究。四、、型受體的結(jié)構(gòu)和TGF-β家族其他成員一樣,MIS和受體結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)和TGF-β家族成員結(jié)合的受體分為Ⅰ型、Ⅱ型,氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)它們是單個跨膜區(qū)域蛋白,有一個富含半胱氨酸的膜外區(qū)和一個膜內(nèi)絲氨酸激酶區(qū)構(gòu)成,Ⅰ、Ⅱ型受體膜內(nèi)絲氨酸激酶區(qū)域的同源性達40%。Ⅰ型受體被認為是不能和配體結(jié)合的孤受體(orphanreceptor)。Ⅰ型受體有多種,其中R1被認為是MISⅠ型受體,人的MISⅡ型受體位于12號染色體q12-13,編碼區(qū)有8kb,共有11個外顯子。MISⅡ型受體mRNA也位于苗勒管,受體本身表達的強弱和MIS表達的高低有密切關(guān)系。文獻報告Ⅱ型受體和受體結(jié)合招募Ⅰ型受體組成各有2個Ⅰ、Ⅱ型受體組成的四聚合體結(jié)構(gòu)。據(jù)推測MIS配體結(jié)合到受體復(fù)合物后會導(dǎo)致Ⅰ型受體經(jīng)由Ⅱ型受體引發(fā)的磷酸化,釋放一些物質(zhì)從而去除信號傳遞路徑上的抑制成分,利于信號傳遞。五、mis功能1.尿生殖哌苗勒管的退化是MIS主要作用。苗勒管在男性胚胎發(fā)育過程中很早就退化。MISmRNA及其蛋白在交配后14.5d時能在雄性大鼠胚胎睪丸Sertoli細胞中測到。Tsuji等應(yīng)用重組人MIS和14.5～18.0d的雌大鼠胚胎的尿生殖嵴(內(nèi)含苗勒管和中腎管)放在一起進行歷時3d的培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)頭側(cè)2/3苗勒管完全消失,1/3～1/2尾側(cè)部雖仍存在,但沿著頭側(cè)方向逐漸變細、管腔變窄。在16.5～18.0d的胚胎,上述3種指標均無明顯區(qū)別。胚胎睪丸分泌MIS并不限制在苗勒管退化期,而是持續(xù)分泌的;然而苗勒管對MIS的反應(yīng)僅限于短短數(shù)天的關(guān)鍵期,如大鼠為交配后14～15d,人類為44～70d。過了敏感期MIS對苗勒管即無作用。2.mis對性分化的影響MIS對性腺也有作用,它可抑制卵巢生殖細胞的減數(shù)分裂。當生殖細胞進入第一次減數(shù)分裂前期時生殖細胞逐漸減少,如果有MIS存在,14～17d內(nèi)生殖細胞快速減少,提示MIS能抑制性細胞增殖。然而這種對生殖細胞的作用依賴于時間和性別,對交配后20d的卵巢和XY性細胞無作用。MIS可引起卵巢組織和卵巢激素分泌的性逆轉(zhuǎn)(sexreversal)。大鼠卵巢和牛MIS一起培養(yǎng)5～10d后,卵巢出現(xiàn)精小管樣結(jié)構(gòu),內(nèi)含Sertoli細胞,生殖細胞消失,出現(xiàn)和生殖器不全牝犢一樣的現(xiàn)象,因此認為MIS導(dǎo)致卵巢的性反轉(zhuǎn),也是MIS可導(dǎo)致睪丸分化的一種依據(jù)。Whitworth等認為MIS對處于有絲分裂的雌性生殖細胞有毒性,由于這些生殖細胞的丟失,導(dǎo)致卵巢的性逆轉(zhuǎn)而不是MIS的直接作用。MIS對性分化的影響在轉(zhuǎn)基因白鼠中可得到印證。大量分泌MIS的轉(zhuǎn)基因雄白鼠中約1/4出現(xiàn)生殖細胞少,睪丸未下降且外陰雌性化。而同樣轉(zhuǎn)基因的雌白鼠其外陰雄性化、無子宮及輸卵管,卵巢內(nèi)生殖細胞在兩周時完全消失,形成精小管樣結(jié)構(gòu),提示MIS對性器官發(fā)育也起關(guān)鍵作用,繼而影響外生殖器的分化。3.脂酰評論員mis對大鼠胚胎肺組織形態(tài)的影響男性新生兒發(fā)生呼吸窘迫綜合征的機率比女性大得多,約為5∶1,其病因是肺的表面清潔物質(zhì)合成缺陷,后者的主要成分為磷脂酰膽堿,由肺的纖維母細胞合成。在試管和活體試驗中濃度極低的牛MIS和重組人MIS可抑制培養(yǎng)中的大鼠胚胎肺的成熟。胚胎肺組織具有上皮生長因子受體,上皮生長因子能導(dǎo)致胚胎肺的形態(tài)和功能成熟,然而MIS卻能在很多方面對抗上皮生長因子的作用。Catlin等從19.5d的大鼠胚胎肺細胞膜上證明MIS可抑制上皮生長因子受體的膜磷酸化,導(dǎo)致肺發(fā)育障礙。4.睪丸無雄激素依賴人類胚胎性腺的頭尾兩側(cè)分別有間葉組織衍化的系帶固定。睪丸下降至陰囊被認為由激素控制,即所謂Hutson的兩階段理論:每一階段由不同的激素控制。在第一階段,即受孕后8～15周,胚胎睪丸的尾側(cè)系帶出現(xiàn)腫脹,頭側(cè)系帶退化,睪丸自后腹壁移動至腹股溝內(nèi)環(huán)處。這一階段的睪丸移動并不依賴雄激素,而是由MIS控制。在第二階段內(nèi)環(huán)處的睪丸在26～40周時下降至陰囊底部,為雄激素依賴性。PMDS(persistentMuellerianductsyndrome)患者的睪丸常常不下降,認為是由于MIS缺乏所致。然而Josso等指出有些PMDS患者的睪丸在腹股溝內(nèi),提示MIS并不是控制第一階段的因素,很可能是闊韌帶和輸卵管機械性阻礙睪丸下降。5.苗勒管組織生長提純的MIS對女性外陰癌和眼黑色素瘤細胞株具有抗增殖作用。此外,還抑制來源于苗勒管組織,如卵巢上皮癌的生長。大部分Ⅲ、Ⅳ期卵巢上皮癌患者腹水中癌細胞和人重組MIS結(jié)合,抑制前者的生長。MIS必須通過蛋白裂解分成羧基端和氨基端兩部分才有抑制腫瘤的作用,羧基端起抑制作用,氨基端延長MIS的半衰期。六、血清mis測定的臨床意義MIS在胎兒期由睪丸Sertoli細胞分泌,出生后仍持續(xù)分泌。女性在胎兒期無MIS表達,在出生后由卵巢顆粒細胞分泌至絕經(jīng)期。新出生男嬰血清MIS值很低,但很快上升,出生后3～4d增加4倍。至青春期為1～5ng/ml。女嬰在出生1年內(nèi)MIS值始終很低,為0.5ng/ml或更低,在整個嬰兒期保持在極低水平,兒童期開始上升至青春期MIS值,為1～5ng/ml,和男性相近。由于MIS分泌在兩性間有差別,因此在臨床上有助于:(1)估計有無睪丸存在:臨床上懷疑為隱睪或兩性畸形等患兒需預(yù)測有功能的睪丸是否存在,可采用HCG刺激后的睪酮值試驗。此法較復(fù)雜,需多次測定血清睪酮值。相比之下血清MIS測定既簡便,又無假陽性結(jié)果。(2)確定兩性畸形的病原:與睪酮估計Leydig細胞的功能一樣,MIS是評估Sertoli細胞的可靠標志,對預(yù)測兩性畸形的病原很有幫助。Rey等對107例各種原因引起的兩性畸形病例(不包括腎上腺性征異常征)行血清MIS測定186次,顯示純粹型和部分睪丸發(fā)育不良者MIS值很低甚至不能測到,睪丸女性化癥、XX男性、真兩性畸形患者的MIS值正常。因此結(jié)合核型鑒定,MIS測定可鑒別不同病原的兩性畸形。(3)診斷性早熟和發(fā)育延遲:不管由于視丘下-垂體活動提早,還是睪丸LH受體活動發(fā)生變化,性早熟男孩的MIS值下降到青春期水平,相反,在發(fā)育延遲的男孩MIS值升高,同時血清FSH值也升高,但HCG刺激后血睪酮反應(yīng)不敏感。女性McCune-Albright綜合征患者常常出現(xiàn)性早熟,由于MIS抑制顆粒細胞的芳香酶合成,認為可抑制雌激素的產(chǎn)生,從而糾正性早熟。(4)作為卵巢腫瘤的瘤標:某些卵巢腫瘤如顆粒細胞瘤分泌大量MIS,它是性索腫瘤的常見類型,約占40%,雖低度惡性,但有晚期復(fù)發(fā)特點。雖然此瘤對MIS的抗增殖作用不敏感,但血清MIS值可作為術(shù)后是否仍有殘余腫瘤和復(fù)發(fā)的標志。(5)確定PMDS的病原。睪丸內(nèi)兩性離子類PMDS是男性假兩性畸形的一種,其特征是外陰部男性樣,但生殖管除中腎管衍化物外,同時存在子宮、輸卵管及上部陰道,至今已有約150例報告,是一種遺傳性疾病,常常因隱睪或腹股溝疝手術(shù)時發(fā)現(xiàn)苗勒管衍化物。根據(jù)睪丸和輸卵管、子宮的相對位置可把此病分成三型:(1)睪丸和輸精管、輸卵管都在腹腔內(nèi)相當于卵巢的部位,兩側(cè)陰囊空虛。(2)一側(cè)睪丸在腹股溝疝或陰囊內(nèi),對側(cè)疝囊內(nèi)有睪丸、輸卵管及子宮,這種類型稱之為腹股溝子宮疝(herniauteriinguinalis)。(3)兩側(cè)睪丸和輸卵管、子宮都在一側(cè)疝囊內(nèi),稱之為睪丸橫過異位(transversetesticularectopia),最少見。根據(jù)血清MIS值PM