超分辨率顯微技術(shù)

超分辨率顯微技術(shù)

Super-resolutionMicroscopy超分辨率顯微技術(shù)SSIM2STED3GSD4STORM5總結(jié)6NSOM1近場掃描光學(xué)顯微鏡Near-fieldScanningOpticalMicroscope(NSOM)遠(yuǎn)場：從近場區(qū)域起至無窮遠(yuǎn)處近場：距離物理外表僅幾個(gè)波長的區(qū)域

輻射場：可向外傳輸?shù)膱龀煞址禽椛鋱觯罕幌拗圃跇悠吠獗聿⑶译S離開外表的距離增加而迅速衰減，不能在自由空間存在探測束縛在物體外表的非輻射場豐富的亞微米光學(xué)信息利用孔徑小于50nm的光纖探針，并且精確地在樣品外表幾十納米以內(nèi)穩(wěn)定、可靠地進(jìn)行光學(xué)信息的掃描成像，即掃描近場光學(xué)顯微鏡，其光學(xué)分辨率到達(dá)波長的幾十分之一。物鏡：孔徑小于波長的小孔裝置，如光纖探針探針與樣品間距的測控光源和照明光路、收集光路和光探測器關(guān)鍵組件成像原理優(yōu)點(diǎn)超越光學(xué)衍射極限的分辨率，甚至可到達(dá)亞納米量級；光學(xué)顯微技術(shù)，無侵入性，可在生物的自然狀態(tài)環(huán)境下進(jìn)行觀測研究；能夠觀測吸收、反射、熒光、偏振比照度，透視生物樣品內(nèi)部光學(xué)性質(zhì)；光譜學(xué)分析，對化學(xué)狀態(tài)具有高分辨率；局域(納米級)光與樣品的相互作用；單分子水平觀測靈敏度，1photon/sec；納米空間分辨率，高時(shí)間分辨率(飛秒)；能在室溫條件下工作缺點(diǎn)貴NSOM優(yōu)缺點(diǎn)應(yīng)用生物學(xué)：有靜態(tài)的形貌像的觀察研究，如細(xì)胞的有絲分裂，染色體的分辨與局域熒光，原位DNA，RNA的測序，基因識(shí)別等，還有利用觀察形貌像隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)過程的研究。微電子：信息的高密度存儲(chǔ)工作原理：非線性結(jié)構(gòu)性光學(xué)照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微鏡，多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。

飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)Saturatedstructureilluminationmicroscopy,(SSIM)優(yōu)點(diǎn)：1、光源只需使用一個(gè)廉價(jià)的激光。2、可以突破分辨率的界限，很大程度上提高分辨率，理論上可以實(shí)現(xiàn)無窮大的分辨率。二位點(diǎn)分辨率實(shí)現(xiàn)50nm。缺點(diǎn)：1、跟通常的光照強(qiáng)度相比，飽和狀態(tài)會(huì)使得熒光分子的漂白率加快，同傳統(tǒng)的單一圖像相比，飽和結(jié)構(gòu)光顯微鏡所觀察到的光子數(shù)需要很高的信噪比。2、飽和結(jié)構(gòu)光顯微鏡實(shí)現(xiàn)高分辨率是在樣品靜止不動(dòng)的假設(shè)上進(jìn)行的，對于有著高速度的胞內(nèi)生命活動(dòng)，成像會(huì)被限制成滯緩的結(jié)構(gòu)。3、對于活標(biāo)本的觀察，飽和結(jié)構(gòu)光顯微技術(shù)會(huì)大大增加光毒性。SSIM優(yōu)缺點(diǎn)受激發(fā)射損耗顯微術(shù)

Stimulated

emissiondepletionmicroscopy(STED)在STED中，有效熒光發(fā)光面積的減小是通過受激發(fā)射效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。一個(gè)典型的STED顯微系統(tǒng)中需要兩束照明光，其中一束為激發(fā)光，另外一束為損耗光。

裝置圖優(yōu)點(diǎn)：1.STED遠(yuǎn)場顯微術(shù)，不僅具有共聚焦非接觸三維成像的功能，而且成功突破了衍射極限的限制，使分辨率提高到了幾十納米。2.與近場掃描光學(xué)顯微鏡相比，不僅突破了衍射極限，而且使觀察不僅局限在樣品外表，而可以看到樣品內(nèi)部。缺點(diǎn)：1.需要強(qiáng)光，能量利用率低；2.過強(qiáng)光會(huì)引起光致漂白；3.應(yīng)用范圍略窄；4.與其他的超分辨顯微鏡相比，本錢較高，操作PLAM/STORM復(fù)雜。STED優(yōu)缺點(diǎn)基態(tài)損耗超高分辨率顯微鏡

GroundstateDepletion(GSD)

分子從基態(tài)S0激發(fā)到第一激發(fā)態(tài)之后，有兩種途徑返回到基態(tài)；一種是通過進(jìn)程〔2〕回到基態(tài)，還有一種就是經(jīng)過一個(gè)次激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，比方三重態(tài)。后者分子將會(huì)自由輻射回基態(tài)?；鶓B(tài)損耗原則說明，在給定的時(shí)間內(nèi)將一局部分子保持在活潑狀態(tài)，有利于單獨(dú)記錄單個(gè)分子的位置狀態(tài)。GSDIM原理：基態(tài)損耗顯微鏡是通過熒光隨機(jī)讀出分子的位置，通過這種方法對圖像上的每個(gè)位置進(jìn)行識(shí)別標(biāo)示，本質(zhì)上，這種方法要依靠算法來確定每個(gè)分子的位置。GSD裝置圖〔參照三維定位顯微鏡的超分辨率系統(tǒng)LeicaSRGSD3D〕1、最大橫向分辨率降至20nm2、在線超分辨率圖像投影-看到真實(shí)原樣的結(jié)果3、在多功能活細(xì)胞成像系統(tǒng)上將超分辨率與TIRF和落射熒光相結(jié)合，提供了全面的應(yīng)用靈活性GSD優(yōu)缺點(diǎn)隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)

StochasticOpticalReconstructionMicroscopy(STORM)兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：單分子定位和光控開關(guān)熒光分子技術(shù)路線：STORM采用光轉(zhuǎn)換熒光探針，在時(shí)間上別離相互重疊發(fā)光的熒光分子，重構(gòu)得到高分辨率圖像。1.單分子定位：對于熒光分子定位分析只要有足夠的光子數(shù)(N)被接收，分析熒光激發(fā)光子光強(qiáng)分布的中心可以實(shí)現(xiàn)高精度的粒子定位。2.熒光分子：熒光分子對Cy3和Cy5，在不同波長激光激發(fā)下，在熒光態(tài)和非熒光態(tài)間轉(zhuǎn)換成像過程Initialconfiguration1.PhotoactivemoleculeMicroscopyUNikon2.Imageactivemolecule3.Localizemolecule4.Photobleach＆recordpositionFinalSTORMimage優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：超越光學(xué)衍射極限的分辨率：與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，空間分辨率可提高10倍，橫向可達(dá)20nm；缺點(diǎn):成像速度慢，難以活細(xì)胞成像；熒光分子濃度要求；成像裝置復(fù)雜昂貴；STORM優(yōu)缺點(diǎn)應(yīng)用與開展應(yīng)用：細(xì)胞形態(tài)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白相互作用

開展：3D-STORM:Z軸分辨率的提升多色STORM:實(shí)現(xiàn)多色熒光成像分析總結(jié)挑戰(zhàn)挑戰(zhàn)：xyz方向分辨率提高；活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)觀測；3D分層掃描；結(jié)果處理軟件標(biāo)準(zhǔn)化；熒光染料選擇；生物樣品準(zhǔn)備等。QUESTION補(bǔ)充材料工作原理：經(jīng)典分辨率限制條件確定了普通顯微鏡所能觀察到的最大空間頻率為k0，k0=2NA/λem.如果將樣品的頻率擴(kuò)展到2維空間，那這一限制可以定義成一個(gè)“觀察區(qū)域〞，是一個(gè)以k0為半徑的圓周，區(qū)域外的信息則無法被觀察到。對于飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡則是通過將區(qū)域外的信息以莫爾條紋的形式移動(dòng)到觀察區(qū)域當(dāng)中，莫爾條紋是由兩個(gè)信號(hào)復(fù)合在一起的混合頻率產(chǎn)生的飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)補(bǔ)充材料如果激發(fā)光包含一個(gè)空間頻率為k1，每個(gè)頻率為k的樣品會(huì)產(chǎn)生一個(gè)頻率為k-k1的莫爾條紋，如果|k-k1|<k0,那么這一條紋便可以由顯微鏡觀察到。那么現(xiàn)在可以檢測到的最大空間頻率變?yōu)閗0+k1。但是，由于產(chǎn)生空間頻率集合的光場以及可觀察到的頻率的集合受到衍射的限制，因此，k0不能大于2NA/λexc≈k0。所以，常見的線性結(jié)構(gòu)光顯微鏡能夠擴(kuò)展分辨率的到達(dá)的因子約等于2。為了突破這一限制，可以通過使發(fā)射率取決于光照強(qiáng)度的非線性變化，這種非線性會(huì)產(chǎn)生有效