生物體內(nèi)藥物分析方法的選擇及應(yīng)用

生物體內(nèi)藥物分析方法及應(yīng)用簡(jiǎn)介2.體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計(jì)與建立3.方法學(xué)確認(rèn)〔評(píng)價(jià)、確證、考評(píng)〕1精選ppt1.1生物樣品分析是藥代研究的必備手段：分析化學(xué)是化學(xué)科學(xué)中的“眼睛〞“眼睛〞是心靈的“窗戶〞透過“窗戶〞獲得大量的信息定量分析定性分析〔半定量〕1.簡(jiǎn)介源于化學(xué)學(xué)科中的分析化學(xué)專業(yè)具有分析化學(xué)的根本概念和要求不同于一般的藥物分析同時(shí)具有生物學(xué)科的特點(diǎn)2精選pptDistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物樣品中藥物的分析測(cè)定是定量描述藥物體內(nèi)過程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一。3精選ppt1.2方法學(xué)類型及特點(diǎn)：體內(nèi)藥物分析方法大致可歸為主要的五類：1.光譜分析法2.色譜法3.毛細(xì)管電泳法4.免疫分析法5.同位素法〔……〕傳統(tǒng)分類方法:集各種方法之長(zhǎng),為我所用:

HPLC-UVHPLC–MRD4精選ppt體內(nèi)藥物分析方法特點(diǎn)：靈敏度高：受到給藥劑量的限制受到生物利用度的限制濃度低:專一性好：生物內(nèi)源性物質(zhì)的干擾體內(nèi)新形成的代謝產(chǎn)物干擾樣品量少：血液〔血漿、血清、全血〕尿、膽汁、唾液、汗、乳汁、精液糞便、組織器官5精選ppt方法快捷：不是專門的方法學(xué)研究，利用方法較快的說明藥理學(xué)的問題?？煽?、重現(xiàn)性好：藥代實(shí)驗(yàn)的不可重復(fù)性。藥物類型多：需要多種儀器、技術(shù)手段的配套6精選ppt1.2.1

光譜分析法

比色法紫外分光光度法:

差示、導(dǎo)數(shù)、雙波長(zhǎng)、三波長(zhǎng)熒光分光光度法1.2.2色譜法:別離效率高;專一性較高HPLC:適用范圍廣;室溫檢測(cè);樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單;流動(dòng)相選擇范圍廣;儀器自動(dòng)化程度高GC:化合物氣化；載氣種類少；方法靈敏，但受到進(jìn)樣量的限制TLC:檢測(cè)條件受限制7精選ppt1.2.3毛細(xì)管電泳法:別離效率高;專一性較高毛細(xì)管區(qū)帶電泳膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管電色譜法進(jìn)樣量少，檢測(cè)條件受限制。8精選ppt

1.2.5

同位素法:靈敏度高;專一性差放射強(qiáng)度表示標(biāo)記藥物量(eq.ng/ml)

同位素技術(shù)與其他分析法相結(jié)合以提高專一性1.2.4

免疫分析法:

放射免疫分析酶免疫分析熒光免疫分析9精選ppt〔二〕、生物樣本的藥物測(cè)定方法生物樣品中的藥物測(cè)定，免疫學(xué)和微生物學(xué)方法。應(yīng)根據(jù)待測(cè)藥物的性質(zhì)，選擇特異性好、靈敏度高的測(cè)定方法。色譜法包括高效液相色譜法〔HPLC〕，氣相色譜法〔GC〕和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。在需要同時(shí)測(cè)定生物樣品中多種化合物的情況下，LC-MS/MS和GC-MS/MS聯(lián)用法在特異性、靈敏度和分析速度方面有更多的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用放射性核素標(biāo)記法測(cè)定血藥濃度應(yīng)配合色法，以保證良好的檢測(cè)特異性。如某些藥物難于用上述的檢測(cè)方法，可選用免疫學(xué)或生物學(xué)方法，但要保證其可靠性。放射免疫法和酶標(biāo)免疫法具有一定特異性，靈敏度高，但原藥與其代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性物質(zhì)常有交叉反響，需提供證據(jù)，說明其特異性。生物學(xué)方法〔如微生物法〕常能反映藥效學(xué)本質(zhì)，但一般特異性較差，應(yīng)盡可能用特異性高的方法〔如色譜法〕進(jìn)行平行檢查。摘自:臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原那么〔第二稿〕〔草案〕10精選ppt2.體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計(jì)與建立2.1體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計(jì)的主要依據(jù)2.1.1

明確分析方法設(shè)計(jì)的目的要求

a.臨床藥物監(jiān)護(hù):

簡(jiǎn)便、快速、批量測(cè)定

b.藥代動(dòng)力學(xué)研究:

是否要求原形藥物與代謝物同時(shí)測(cè)定注意整個(gè)濃度變化的范圍樣品量多,方法盡可能簡(jiǎn)便11精選pptc.配合新藥設(shè)計(jì)合成、藥理、毒理學(xué)的研究:藥物是否吸收?生物利用度如何?T1/2?Tmax?Cmax?化合物藥代的快速評(píng)價(jià)要求方法學(xué)簡(jiǎn)單，快捷的提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

d.新藥報(bào)批:參照SFDA公布的指導(dǎo)原那么,按照SOP進(jìn)行試驗(yàn).較快的獲得信息12精選ppt2.1.2

了解待測(cè)藥物的特性,調(diào)研文獻(xiàn)

藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)

檢測(cè)方法?溶解度?穩(wěn)定性?……

藥物的藥理和毒理作用機(jī)制

生物樣品:動(dòng)物屬性?組織器官?

(同一類化合物的)體內(nèi)代謝情況藥物的劑量給藥途徑

干擾成分的多少樣品的預(yù)處理方法13精選ppt2.1.3

儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)室條件

文獻(xiàn)資料的可參考性?可重復(fù)性?

別人可做的事情是否適合我們?

實(shí)驗(yàn)室硬件建設(shè)是否與研究課題相互匹配?

藥物就是藥物！它不是一般的化合物。應(yīng)掌握和理解它的藥效和毒性作用機(jī)制、理化性質(zhì)、將來的臨床應(yīng)用等等。只有對(duì)其加深理解才能進(jìn)行深入的代謝研究，包括藥物代謝研究所采用的方法技術(shù)。14精選ppt2.2體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計(jì)與建立的一般步驟總的原那么：根據(jù)被測(cè)藥物的性質(zhì)藥物濃度的大致范圍(經(jīng)驗(yàn)估計(jì))儀器設(shè)備條件對(duì)藥物和研究目的的理解程度靈敏專一簡(jiǎn)捷可行

初步分析方法的預(yù)試優(yōu)化確認(rèn)15精選ppt以藥物進(jìn)行測(cè)定空白生物介質(zhì)+藥物空白生物介質(zhì)(雜質(zhì))給藥后的生物樣品(有無(wú)藥物?產(chǎn)物?)考慮內(nèi)標(biāo)的選擇方法學(xué)的可行性驗(yàn)證評(píng)價(jià)16精選ppt3.方法學(xué)確認(rèn)〔評(píng)價(jià)、確證、考評(píng)〕〔validation〕“生物樣品測(cè)定的關(guān)鍵是方法學(xué)確實(shí)證。方法學(xué)確證是整個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)研究的根底。這是藥代動(dòng)力學(xué)研究有別于其它藥理毒理研究的特殊之處。所有藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測(cè)定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果。在通過特異性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等研究建立了檢測(cè)方法學(xué)，得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線后，在檢測(cè)過程中還應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)控，制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線并對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，以確保檢測(cè)方法的可靠性。〞摘自:臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原那么〔第二稿〕〔草案〕17精選ppt生物介質(zhì)：一種生物來源物質(zhì)，能夠以可重復(fù)的方式采集和處理。例如全血、血漿、血清、尿、糞、各種組織等。準(zhǔn)確度：在確定的分析條件下，測(cè)得值與真實(shí)值的接近程度。分析批：包括待測(cè)樣品、適當(dāng)數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)樣品和QC樣品的完整系列。一天內(nèi)可以完成幾個(gè)分析批，一個(gè)分析批也可以持續(xù)幾天完成。3.1名詞解釋:18精選ppt重現(xiàn)性：不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定結(jié)果的分散程度，以及相同條件下分析方法在間隔一段短時(shí)間后測(cè)定結(jié)果的分散程度。介質(zhì)效應(yīng)：由于樣品中存在干擾物質(zhì)，對(duì)響應(yīng)造成的直接或間接的影響。穩(wěn)定性：一種分析物在確定條件下，一定時(shí)間內(nèi)在給定介質(zhì)中的化學(xué)穩(wěn)定性。精密度：在確定的分析條件下，相同介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測(cè)量值的分散程度。19精選ppt標(biāo)準(zhǔn)曲線：實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值與分析物濃度間的關(guān)系。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)募訖?quán)和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，用簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)模型來最適當(dāng)?shù)孛枋?。?biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)是連續(xù)的和可重現(xiàn)的，應(yīng)以回歸計(jì)算結(jié)果的百分偏差最小為基礎(chǔ)。質(zhì)控樣品：即QC樣品，系指在生物介質(zhì)中加入已知量分析物配制的樣品，用于監(jiān)測(cè)生物分析方法的重復(fù)性和評(píng)價(jià)每一分析批中未知樣品分析結(jié)果的完整性和正確性。標(biāo)準(zhǔn)樣品：在生物介質(zhì)中加入已知量分析物配制的樣品，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品和未知樣品中分析物濃度。20精選ppt

定量范圍：包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的濃度范圍，在此范圍內(nèi)采用濃度-響應(yīng)關(guān)系能進(jìn)行可靠的、可重復(fù)的定量，其準(zhǔn)確度和精密度可以接受。選擇性：分析方法測(cè)量和區(qū)分共存組分中分析物的能力。這些共存組分可能包括代謝物、雜質(zhì)、分解產(chǎn)物、介質(zhì)組分等回收率：分析過程的提取效率，以樣品提取和處理過程前后分析物含量百分比表示。21精選pptnominalconcentration:

真實(shí)濃度(濃度真值;算術(shù)值)

如:配置溶液(1.3mg/ml);

標(biāo)曲或QC中的0.xng/mlfortifiedSamples:

processedsamples

stocksolution

standardsamples

authenticsamples:

與試驗(yàn)物質(zhì)完全相同的樣品

(或根據(jù)試驗(yàn)樣品復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)品)22精選ppt3.2體內(nèi)藥物分析方法的評(píng)價(jià)內(nèi)容：1.Selectivity:

SFDA/FDA2.

LinearRangeandResponseFactor：

S/F3.

Inter-DayPrecisionandAccuracy:

S/F4.

Intra-DayPrecisionandAccuracy:

S/F5.DilutionIntegrity:F6.

Sensitivity:

S/F7.

Recovery(ExtractionEfficiency)

S/F8.MatrixEffects:F9.

CarryoverEvaluationF10.

Stability:

S/F11.RelativeRetention:F23精選ppt3.2.1Selectivity:被測(cè)組分與內(nèi)源性物質(zhì)、試劑中雜質(zhì)、代謝產(chǎn)物以及其它干擾物質(zhì)有良好的別離;必須證明所測(cè)定的物質(zhì)是預(yù)期的分析物，內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物不得干擾樣品的測(cè)定。對(duì)于色譜法至少要考察6個(gè)不同來源空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖〔注明濃度〕及用藥后的生物樣品色譜圖。對(duì)于質(zhì)譜法那么應(yīng)著重考察分析過程中的介質(zhì)效應(yīng)。24精選ppt1.被試驗(yàn)藥物標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖2.正常生物樣品〔空白〕的色譜圖3.空白生物樣品外加被試藥物的色譜圖4.給藥后的生物樣品的色譜圖試驗(yàn)報(bào)告(論文)中應(yīng)提供:25精選ppt3.2.2LinearRangeandResponseFactor：必須用至少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=/>5);應(yīng)使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì);定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)濃度;不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)隨行空白生物樣品，但計(jì)算時(shí)不包括該點(diǎn)。26精選ppt

標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)試驗(yàn)報(bào)告(論文)中應(yīng)提供:5.空白生物樣品外加被試藥物(低,中,高三個(gè)濃度;n>5)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的反算(back-calculated)測(cè)定濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍最低和最高濃度樣品的色譜圖27精選pptTabX.StandardCurveReadbackConcentrationsforXX藥物

-20%0.80-15%1.704.2517.085.0425850+20%1.20+15%2.305.7523.01155751150NominalConcentrations(ng/ml)

1.002.05.0020.010050010001.071.984.6718.397.448310020.9212.105.1720.11065111063

1.042.104.6920.41024869911.052.215.20(a)10249110380.9462.215.2019.91024951073…

平均值:ABCEFGHSDIJKLMNORSD%PQRSTUV%REWXYZABCnn1n2n3n4n5n6n7AcceptanceCriteria28精選ppt3.2.3Inter-DayPrecisionandAccuracy:3.2.4Intra-DayPrecisionandAccuracy:Precisionofthemethod,definedbythepercentrelativestandarddeviation(%RSD=〔standarddeviation〕÷〔mean〕×100)，wasdeterminedfromtheinterpolatedQCsampleconcentrations.Accuracyofthemethod,definedbythepercentrelativeerror(%RE=〔standardobservedconcentration－nominalconcentration〕÷〔nominalconcentration〕×100)PrecisionandAccuracy29精選pptPrecision:10ng/ml10ng/mlAccuracy30精選ppt要求選擇3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度選擇在定量下限〔LLOQ〕附近，其濃度在LLOQ的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；中間選一個(gè)濃度。每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品，為獲得批間精密度應(yīng)至少連續(xù)測(cè)定3個(gè)分析批。精密度用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差〔RSD〕表示，RSD一般應(yīng)小于15%，在LLOQ附近RSD應(yīng)小于20%。準(zhǔn)確度一般應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)，在LLOQ附近應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)。31精選ppt空白生物樣品外加被試藥物(低,中,高三個(gè)濃度;n>5)的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度Inter-Day和Intra-Day

PrecisionandAccuracy:國(guó)內(nèi)一般做法：1.00n=510.0+血漿n=550.0n=5同一天日內(nèi)1次/日；連測(cè)5天日間5個(gè)平行樣品合為一體；分5次進(jìn)樣32精選ppt濃度樣品管測(cè)定結(jié)果1.01…2…3…4…5…10

1…2…3…4…5…

1001…2…3…4…5…合為一起日內(nèi)分5次測(cè)定合為一起日內(nèi)分5次測(cè)定合為一起日內(nèi)分5次測(cè)定假設(shè)每日測(cè)定1次,連續(xù)測(cè)定5次，得日間結(jié)果數(shù)據(jù)處理33精選pptNominalConcentrations(ng/ml)3.0075.0750

3.4673.5711………

平均值:ABC

SDIJK

RSD%PQR

%REWXY

n666TabX.QualityControlSampleConcentrationforXX藥物3.2375.6733………

平均值:ABC

SDIJK

RSD%PQR

%REWXY

n6661234精選pptInter-DayStatistics

平均值:ABC

SDIJK

RSD%PQR

%REWXY

n3029303.2375.6733………

平均值:ABC

SDIJK

RSD%PQR

%REWXY

n6663535精選ppt3.2.5DilutionIntegrity:如何測(cè)定超出線性范圍的樣品?Range:10—200ng/ml對(duì)大于200ng/ml的樣品要進(jìn)行稀釋:500ng/ml50ng/ml10X所處理和測(cè)定的結(jié)果是否符合要求:50ng/ml的可信限之內(nèi)(50±ng/ml)36精選ppt

表xx.DilutionIntegrityforxxDrugAcceptanceCriteria

-15%42500+15%57500NominalConcentrations(ng/ml)Acceptance

50000Ratio

4747849950477946/6512044926553459平均值:49858

SD2239%RSD4.49%RE-0.284n6AcceptanceRatio:在“AcceptanceCriteria”允許范圍內(nèi)的樣品數(shù)目除以分析的樣品總數(shù)37精選ppt對(duì)小于10ng/ml的樣品如何處理:10ng/ml20ng/mlRange:10—200ng/mlx2所處理和測(cè)定的結(jié)果是否符合要求:10ng/ml的可信限之內(nèi)(10±ng/ml)38精選ppt3.2.6Sensitivity:定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，要求至少能滿足測(cè)定3～5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度，其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%～120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試結(jié)果證明。最低檢測(cè)濃度(X/ml)最低檢測(cè)量(X)最低定量下限(LLOQ)39精選ppt

表xx.SensitivityforxxDrugNominalConcentrations(ng/ml)Run(1.00)

1

0.8420.9850.8910.9131.150.88821.010.7830.9760.9421.000.880平均值:0.938

SD0.0951%RSD10.1%RE-6.02n12標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)表明：LLOQ為1ng/ml；該濃度的精密度為10.1%；該濃度的準(zhǔn)確度為-6.0240精選ppt3.2.7Recovery(ExtractionEfficiency)提取回收率:

應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)一致、精密和可重現(xiàn)。

低、中、高(3個(gè)濃度):回收率不低于70%(原規(guī)定)

回收率不低于50%(改為)41精選ppt萃取回收率:

Mean

MeanConc.PeakArea

PeakArea

PeakArea

Percent

PercentSD(ng/ml)Fortified

Fortified

Processed

Recovery

Recovery

Samples

Samples

Samples

A1

A

B1B1/A

CD

A2B2B2/A

A3B3B3/A

A4B4B4/AB5B5/A

M.E1

E

F1F1/E

GH

E2F2F2/E

E3F3F3/EE4F4F4/EF5F5/E

H.I1

I

J1J1/I

KL

I2J2J2/I

I3J3J3/II4J4J4/IJ5J5/I

42精選ppt方法回收率:低中高(3個(gè)濃度)的參加量與檢出量的比較.L.M.H.Conc.測(cè)定量參加量回收率回收率(ng/ml)(ng/ml)(ng/ml)(%)(平均)123456789101112131415L.M.H.212223242526272829303132333435ABC43精選ppt3.2.8MatrixEffects:在采用質(zhì)譜方法進(jìn)行體內(nèi)藥物定量檢測(cè)時(shí),應(yīng)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn),觀察基質(zhì)對(duì)藥物測(cè)定的影響.基質(zhì)〔matrix〕尚無(wú)統(tǒng)一的解釋，曾稱為“一種分析物〔analyte〕的環(huán)境〔milieu〕〞，即指標(biāo)本中除分析物以外的一切組成。以血清膽固醇〔Chol〕測(cè)定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化學(xué)性質(zhì)?；|(zhì)效應(yīng)〔matrixeffect〕對(duì)臨床化學(xué)分析的影響越來越受到人們的重視。最早是在酶動(dòng)力測(cè)定中用人工制備的參考物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。44精選ppt基質(zhì)效應(yīng)〔matrixeffect〕按NCCLS文件的定義，指:〔1〕標(biāo)本中除分析物以外的其他成分對(duì)分析物測(cè)定值的影響?！?〕基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物的能力的干擾。廣義說來，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)包括的干擾物〔如Chol測(cè)定中膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸等都是干擾物〕，但目前只將基質(zhì)效應(yīng)限于生物材料中未知或未定性的物質(zhì)或因素〔如粘度、pH等〕的影響。45精選ppt減少基質(zhì)效應(yīng)的研究方向，至今仍有參考價(jià)值：①改進(jìn)室內(nèi)質(zhì)控樣品；②改進(jìn)儀器設(shè)計(jì)及試劑組成；③選擇方法及方法學(xué)參數(shù)，使其適應(yīng)性更強(qiáng)且易于掌握，對(duì)制備物〔如標(biāo)準(zhǔn)液，室間質(zhì)控樣品與質(zhì)控物〕基質(zhì)確實(shí)切性不敏感。46精選pptMatrixFactor(MF;基質(zhì)因子):peakarea(fortifiedsamples)peakarea(analyticalsamples)fortifiedsamples:生物介質(zhì)樣品處理參加待測(cè)藥物測(cè)定analyticalsamples:標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定

(兩種測(cè)定方式的藥物濃度相等)47精選pptISadjustedMatrixFactor(內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)因子):基質(zhì)因子是采用色譜峰面積峰面積計(jì)算.內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)因子是采用色譜峰面積的比值計(jì)算.[ratiosofpeakarea(Drug/IS)](fortifiedsamples)[ratioofpeakarea(Drug/IS)](analyticalsamples)(兩種測(cè)定方式的藥物濃度相等)基質(zhì)因子為1,說明藥物的測(cè)定無(wú)基質(zhì)效應(yīng)影響.基質(zhì)效應(yīng)影響范圍(基質(zhì)因子;內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)因子)在某一個(gè)區(qū)間可被接受.(0.8-1.2)48精選pptDrug峰面積IS峰面積

PARMFIS校正后MFMeanMean

（A）（B）（A/B）（A/C）

[（A/B）/D]MFIS校正后MF

11404394160.2890.9681.061.020.98810658512960.2580.9050.945……………10557394570.2680.8960.9820.9231.03……………………………………………………………………………………………………Mean0.9670.997SD0.0530.017%RSD5.471.72N66Tabxx.MatrixEffectsforxxdrugDrug峰面積IS峰面積

PARDrug峰面積均值

MeanPAR

（A）（B）（A/B）

（C）

(D)402400.269117780.273………analyticalsamplesfortifiedsamples

run1run2run3run4run5run649精選ppt3.2.9CarryoverEvaluation在方法評(píng)價(jià)中，線性的最高濃度〔如1000ng/ml〕被測(cè)試之后，必須測(cè)試試劑空白樣品來評(píng)價(jià)Carryover。在樣品出峰的時(shí)間〔RT〕,試劑空白樣品可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)相應(yīng)的信號(hào)，這個(gè)信號(hào)是LLOQ的百分之幾〔LLOQ%〕?LLOQ:1.0ng/ml;Acceptance:0.8---1.2ng/ml,(1.0ng/ml的±20%);在進(jìn)樣高濃度樣品時(shí)，在分析系統(tǒng)中會(huì)產(chǎn)生“攜帶污染〞；“污染〞到什么程度時(shí)，分析方法可以接受；什么程度時(shí)，分析方法不可以接受；50精選pptCarryover可允許接受的范圍“≤20%ofLLOQ〞如果：方法學(xué)的LLOQ=1ng/ml(1ng/ml×X)≤20%

那么：

X≤0.2ng/ml

51精選ppt假定：在validation試驗(yàn)中，觀察到1000ng/ml〔線性范圍的最高濃度〕樣品引起50%ofCarryover(殘留量)，指的是LLOQ的50%;(1ng/ml的50%=0.5ng/ml)1000ng/ml的殘留率：(0.5ng/ml÷1000ng/ml=0.05%〕“cut-off〞濃度(殘留量在20%的LLOQ以下的藥物濃度)：1000ng/ml÷0.5ng/ml=X÷0.2ng/mlX=400ng/ml〔1000ng/ml的殘留量為0.5ng/ml,多大濃度的殘留量為20%的LLOQ？解“一元一次方程〞所得到的濃度就是分析方法所分析的最大濃度?！?2精選ppt1000ng/ml的樣品所引起的殘留為0.5ng/ml；殘留率為0.05%。假設(shè)要求所引起的殘留為L(zhǎng)LOQ〔1ng/ml〕的20%(0.2ng/ml)，那么該樣品的濃度應(yīng)≤400ng/ml。假設(shè)某一個(gè)樣品的濃度400ng/ml≤，那么所操作的下一個(gè)樣品就要求重新進(jìn)行驗(yàn)證。53精選ppt3.2.10Stability:生物樣品在處理前,室溫放置的穩(wěn)定性(BenchtopStability).(2)生物樣品在處理前,4℃放置的穩(wěn)定性低(n=5)中(n=5)高(n=5)

放置一定時(shí)間處理測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)從實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)際情況出發(fā),如觀察時(shí)間,存放溫度等.54精選ppt

表xx.XX介質(zhì)中XX藥物在XX條件下的穩(wěn)定性試驗(yàn)

AcceptanceCriteria

-15%0.9912.885.0+15%1.0217.3115NominalConcentrations(ng/ml)Acceptance

1.0015.0100Ratio

0.9913.087.88/91.0116.798.01.0517.1114.8

平均值:A

BC

SDEFGRSD%HIJn333AcceptanceRatio:在“AcceptanceCriteria”允許范圍內(nèi)的樣品數(shù)目除以分析的樣品總數(shù)55精選ppt(3)Freeze/ThawStability:觀察生物樣品經(jīng)反復(fù)屢次凍-融后的穩(wěn)定性;低、中、高三個(gè)濃度;(或低、高二個(gè)濃度);標(biāo)明凍存條件的溫度(如:-20℃或-70℃等);標(biāo)明融化后樣品所處的溫度(如:20℃或25℃或室溫等);Freeze/Thaw的周期數(shù).56精選ppt

表xx.XX介質(zhì)中XX藥物經(jīng)4次凍(-20℃)融(25℃)

后的穩(wěn)定性試驗(yàn)

AcceptanceCriteria

-15%0.9912.885.0+15%1.0217.3115NominalConcentrations(ng/ml)Acceptance

1.0015.0100Ratio

0.9913.087.812/121.0116.798.0

1.0017.1114.80.991.70103.3

平均值:A

BC

SDEFGRSD%HIJn444AcceptanceRatio:在“AcceptanceCriteria〞允許范圍內(nèi)的樣品數(shù)目除以分析的樣品總數(shù)57精選ppt(4)ExtractStability:觀察生物樣品經(jīng)處理后,待測(cè)樣品放置一定時(shí)間的穩(wěn)定性;低、中、高三個(gè)濃度;(或低、高二個(gè)濃度);標(biāo)明放置的時(shí)間(如:50小時(shí)等);標(biāo)明放置的條件(如:10℃等);58精選ppt

表xx.XX介質(zhì)中XX藥物經(jīng)處理后在xx條件放置xx小時(shí)的穩(wěn)定性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)斜率[1/(ng/ml)]截距相關(guān)系數(shù)

0.00xxx0.00xxx0.999xx

StansardCurveReadbackConcentrationsAcceptanceCriteria

-20%0.800-15%1.704.2517.085.0425850+20%1.20+15%2.305.7523.01155751150

NominalConcentrations(ng/ml)1.002.005.0020.01005001000

0.9711.945.2020.499.74939571.011.895.0119.71025011121Mean----------------------%RE----------------------n222222259精選ppt

(續(xù))

XX介質(zhì)中XX藥物經(jīng)處理后在xx條件放置xx小時(shí)的穩(wěn)定性試驗(yàn)

AcceptanceCriteria-15%2.2563.8638

+15%3.4586.3863

NominalConcentrations(ng/ml)Acceptance

3.0075.0750

Ratio

3.1774.069515/152.9876.47002.8177.27012.8077.86973.2174.2731Mean---------SD---------n555