DNA條形碼鑒定茄屬種質(zhì)技術(shù)規(guī)程

1DNA條形碼鑒定茄屬種質(zhì)技術(shù)規(guī)程本標準規(guī)定了DNA條形碼鑒定茄屬種質(zhì)的術(shù)語和定義、原理、儀器設(shè)備與主要試劑耗材、溶液配制、DNA條形碼引物、DNA條形碼序列、參照種質(zhì)、DNA條形碼序列的獲取和DNA條形碼比對及結(jié)果判定。本標準適用于茄屬種質(zhì)栽培茄（Solanummelongena）、水茄（S.和蒜芥茄（S.sisymbriifolium）DNA條形碼的測定、結(jié)果比對分析與判定。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。2.1待測種質(zhì)testedgermplasm待鑒定的疑似栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄種質(zhì)，由送檢人提供。2.2參照種質(zhì)referencegermplasm用于與待測種質(zhì)進行PCR擴增片段大小比較或DNA條形碼比對的標準栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄種質(zhì)：贛茄1號、改良托魯巴姆、HC002和HC003（附錄4）。2.3DNA條形碼DNAbarcodeDNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段，DNA條形碼技術(shù)可用于鑒定物種及物種間親緣關(guān)系。matK：植物葉綠體中賴氨酸t(yī)RNA內(nèi)含子內(nèi)的成熟酶（參與RNA轉(zhuǎn)錄本中II型內(nèi)含子剪切）編碼基因。psbA-trnH：植物葉綠體psbA基因和trnH基因間的間隔序列。23方法原理根據(jù)茄屬種質(zhì)的matK或psbA-trnH序列特征，應用DNA條形碼技術(shù)對茄屬種質(zhì)栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄進行鑒定。4儀器設(shè)備與主要試劑耗材儀器設(shè)備及試劑、耗材參見附錄A。5溶液配制溶液配制方法參見附錄B。6DNA條形碼引物DNA條形碼引物相關(guān)信息見附錄C。7DNA條形碼序列DNA條形碼序列相關(guān)信息見附錄D。8參照種質(zhì)參照種質(zhì)參見附錄E。在進行等位變異檢測時，應同時包括相應參照材料。9DNA條形碼序列的獲取9.1樣品準備取0.2~0.5g待測種質(zhì)或參照種質(zhì)的植物組織置于2ml離心管中，做好標記。9.2DNA提取9.2.1待測種質(zhì)和參照種質(zhì)采用改良CTAB法提取DNA，步驟如下：a）取直徑為6mm鋼珠2粒放入裝有樣品的2ml離心管中，加入預熱至65℃的CTAB溶液800μL，于植物組織研磨儀中充分研磨后，65℃水浴20min。b）取出離心管加入600μL氯仿/異戊醇（24：1）溶液后，上下顛倒混勻，10,000rpm離心10min。3c）取上清液400μL于新的1.5ml離心管，加入800μL無水乙醇并混勻，10,000rpm離心10min。d）去上清液，加入75%無水乙醇，顛倒混勻后于10,000rpm離心2min，棄上清，自然晾干后加50μLddH2O溶解DNA。e）用超微量分光光度計檢測DNA濃度，用ddH2O將DNA稀釋到100ng/μL，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2若待測種質(zhì)樣本量少，或樣本已降解或部分降解，可購買專用試劑盒提取DNA，按照試劑盒的說明進行提取，并按照9.2.1步驟e）的方法存放。9.3PCR擴增9.3.1PCR反應體系PCR反應體系為：2×TaqMasterMix（含染料）20μL，10μM正向引物（附錄C表C.1）和反向引物（附錄C表C.1）各0.4μL，100ng/μL的DNA模板2.0μL，ddH2O補齊至40μL。每管PCR體系滴入一滴液體石蠟防止蒸發(fā)。9.3.2PCR反應程序所述PCR反應程序：94℃預變性2min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，38個循環(huán)；72℃延伸5min。9.4PCR擴增產(chǎn)物檢測9.4.1凝膠制備稱取1.2g瓊脂糖于三角瓶中，加入120ml1×TAE緩沖液，在微波爐中加熱至完全溶解后自然冷卻至約50℃,加入12μL核酸凝膠染色試劑GelRed（10,000×水溶液），混勻后倒于放有凝膠托盤的制膠盒中，垂直將加樣梳插入制膠盒的小凹槽中。9.4.2電泳及檢測瓊脂糖膠凝固后，垂直撥出加樣梳，將凝膠托盤取出置于電泳槽中，用移液器吸取5μLDL2000Marker點于每排第一個加樣孔，其后依次加入4μL待檢測PCR產(chǎn)物。將電泳儀設(shè)置為恒壓150V，待指示染料遷移至凝膠2/3處時，取出于凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR條帶。參照種質(zhì)的matK片段大小為1032bp，psbA-trnH片段大小為745bp，待測樣品條帶大小應與參照種質(zhì)條帶大小基本一致，對待測樣品PCR產(chǎn)物進行Sanger測序，獲取DNA條形碼序列。10DNA條形碼比對及結(jié)果判定4將疑似栽培茄待測種質(zhì)matK片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對（/Blast.cgi相似度最高的為栽培茄；與序列1（附錄D.1）進行比對，對應序列1的第491位堿基為C，同時第726位堿基為T，則確定待測種質(zhì)為栽培茄。將疑似水茄待測種質(zhì)matK片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，相似度最高的為水茄；與序列1（附錄D.1）進行比對，對應序列1的第682位堿基為T，則確定待測種質(zhì)為水茄。將疑似喀西茄待測種質(zhì)psbA-trnH片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，相似度最高的為喀西茄；與序列2（附錄D.2）進行比對，對應序列2的第232位堿基為A，則確定待測種質(zhì)為喀西茄。將疑似蒜芥茄待測種質(zhì)matK片段兩端質(zhì)量低的DNA序列截去后，在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，相似度最高的為蒜芥茄；與序列1（附錄D.1）進行比對，對應序列1的第645位堿基為C，則確定待測種質(zhì)為蒜芥茄。（資料性附錄）主要儀器設(shè)備與試劑、耗材A.1主要儀器設(shè)備A.1.2純水儀。電子天平。磁力攪拌器。恒溫水浴鍋。高速離心機。A.1.8超微量分光光度計。A.1.9PCR儀。A.1.10微波爐。A.1.12凝膠成像系統(tǒng)。A.1.13冰箱。A.2主要試劑A.2.1十六烷基三乙基溴化銨（CTAB，AR）。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮K-30（PVPK-30，AR）。A.2.3乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA，AR）。A.2.4二水乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O，AR）。A.2.5冰乙酸（CH3COOH，AR）。A.2.6氯化鈉（NaCl，AR）。A.2.7三羥甲基氨基甲烷（Tris堿，AR）。A.2.8氯仿（CHCl3，AR）。A.2.9異戊醇（C5H12O，AR）。A.2.10無水乙醇（C?H?O，AR）。A.2.11氫氧化鈉（NaOH，AR）。A.2.122×TaqMasterMix。A.2.13DNAMarker（DL2000）。A.2.14液體石蠟（AR）。A.2.15DNA條形碼引物。A.2.16ddH2O。A.3主要耗材A.3.1離心管（1.5ml，2.0ml）。A.3.2移液器及配套槍頭。A.3.3槍頭盒。A.3.4A.3.5藍蓋試劑瓶。A.3.6A.3.7一次性手套。A.3.8乳膠手套。A.3.9量筒。A.3.10玻璃棒。A.3.11三角瓶。A.3.12制膠盒A.3.13凝膠托盤A.3.14加樣梳。7（規(guī)范性附錄）溶液配制B.1DNA提取液的配制稱取Tris-HCl12.44g，NaCl81.82g，Na2EDTA7.45g，CTAB20g，PVPK-3020g，加ddH2O至800ml刻度處，于65℃加熱使其充分溶解，待溶液冷卻至室溫后用NaOH將pH調(diào)至8.0。B.1.2氯仿/異戊醇（24:1）溶液量取480ml氯仿，20ml異戊醇置于棕色玻璃瓶中，混勻備用。B.1.375%無水乙醇量取375ml無水乙醇，125mlddH2O于棕色玻璃瓶中，混勻備用。B.2PCR擴增溶液的配制B.2.1DNA條形碼引物稀釋裝有引物（見附錄C）粉末的離心管在離心機中5000r/min離心2min，加適量ddH2O將引物稀釋B.3瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液的配制B.3.150×TAE緩沖液稱取Tris堿242g，Na2EDTA·2H2O37.2g，加ddH2O至800ml刻度處，攪拌混勻，加入57.1ml冰乙酸，加ddH2O定容至1000ml。（規(guī)范性附錄）DNA條形碼引物見表C.1表C.1DNA條形碼引物編號目標DNA條形碼引物序列(5'→3')1matKF:ACAAAAAATATCCAAATACCAAATCCR:CCCGTTCATCTGGAAATCTTG2psbA-trnHF:ATCCACTTGGCTACATCCGCR:CAACAACTCTCGTTCGTTACACTTC（資料性附錄）D.1matK序列acaaaaaatatccaaataccaaatccgacttctatatactccccacaaatcgtgggaaggtcaaagaaagaacttgttcttccgacgttaagaattcttccaatcgagcccgatcttttcaaaaaagtgcgtacagtacttttgtgtttccgagagcacaagaaagtcgaagtatatactttattcgatataaagtcttttttgctataataatgaaaaagatttctgcatatacgcccaaatcggtcaataatgataaatcggaccaaactggtttactaatgggatgccctaatacggtacaaatttagctaatgatccaatcaaaggaataattggaacaagggtctcgaacttcttattattgattagaaatgaattttctaacatttgactacgtaccattgaacacacttgaaagatagcccataaagtcacgggaatggttggataattggtccttcctgtgtgaaagtacatagaaaaatgacattgccaaaaattgacaaccatttattcatcaaaggaaacgtcccttttgaagccagaattgattttcaacataatgcatgaaaggatccttgaataaccatagggtaacctgaaaagacttctacaagacgttctatttttccatagaaatatattcgttcaagaaagatgttgatcgtaaatgagaagattggttccgtagaaagacgaaagtgatatacataagaattatataagaagaagaagaatctttgattttttttaccgggcttctttgaagtaataagactattcaaattacaatattcgtgtaataaatgtaaagaagaggcatcttttacccaatagcgaagagtttgaaccaaD.2psbA-trnH序列atccacttggctacatccgccccctcccctactgatgacattccatttttaattagaaaacaaaagatttaagttcgaatatttctcttctttcttatttaatgatagtattatttcgattattatttcaaagatatgaaagatatgagattttttatgtgaaatgcaataaaaagatatagtaacattagcaacaaatatttctttgaaataaatagaaaatcaaaatcgaatactcaatcatgcaaataccctctccttctttttctataatttaaacaaaaaagtctatgtctaggaaattaataataaaaaaaaaaaaaagaaaggagcaatagcaccctcttgaaagaaaatggttattgctcctttcttttcaaaacctcctatagactagatccatttgtagatggagcttcgatagcagctaggtctagagggaagttatgagcattcatgcataacttccataccaaggttagcacggttgatg