不結(jié)球白菜抗壞血酸合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)及BcPMI2的功能分析

不結(jié)球白菜抗壞血酸合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)及BcPMI2的功能分析抗壞血酸(AsA),又稱維生素C,是動植物體內(nèi)維持生命所必需的一種物質(zhì)。植物的AsA含量由AsA合成和消耗的速率共同決定。高等植物中AsA合成的主要途徑是L-半乳糖途徑,L-半乳糖途徑包括8個典型的生理生化反應(yīng),也就對應(yīng)著8個催化這些反應(yīng)的酶,植物通過調(diào)節(jié)編碼這些酶的基因的表達(dá)量改變細(xì)胞內(nèi)這些酶的總活力,從而調(diào)節(jié)AsA的合成速率和AsA的積累。通過外界或人為地改變一些酶的活力同樣可能影響到植物AsA的積累。1.測量經(jīng)過高pH值處理的植物樣品提取液與未經(jīng)過高pH值處理的提取液在245nm下吸光值的差值,可以計算植物樣品提取液中的還原型AsA的濃度。本研究針對該方法比較了不同的方法降解AsA的效果。最后應(yīng)用該方法測定不結(jié)球白菜樣品的AsA含量,并與紅菲羅啉法測定AsA的結(jié)果進(jìn)行比較,兩種方法對于不同樣品的AsA含量高低關(guān)系基本一致。本方法加標(biāo)回收率在90%以上,同品種的測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%-12%之間。2.本研究在貯藏過程中采用二氧化碳?xì)怏w(CO2)處理采后不結(jié)球白菜,減緩了AsA含量的下降。同時發(fā)現(xiàn)其他活性物質(zhì),包括可溶性蛋白和葉綠素的損失都可被CO2抑制；CO2處理可抑制過氧化氫清除酶系統(tǒng)中的過氧化氫酶(CAT),抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)活力的升高,說明高濃度CO2可以降低植物衰老過程中活性氧脅迫的影響,從而減少AsA等活性物質(zhì)的消耗。50%和100%的CO2處理都可延緩采后不結(jié)球白菜貯藏過程中AsA含量的下降,而前者的處理效果要優(yōu)于后者。在室溫下(25℃)CO2處理對AsA的保持效果較明顯,4℃下CO2處理的效果沒有明顯優(yōu)于空氣處理；在CO2處理的條件下,不同溫度處理對AsA的改變也不明顯。3.L-半乳糖途徑各個基因的表達(dá)量對AsA積累有決定性的作用。本研究克隆了7個L-半乳糖途徑的相關(guān)基因,采用實(shí)時定量PCR的手段分析了L-半乳糖途徑的各個基因在AsA含量不同的品種中的表達(dá)差異。結(jié)果表明不結(jié)球白菜品種‘烏塌菜’的AsA含量較高并不是因?yàn)長-半乳糖途徑中某個基因的表達(dá)量較高。5mM的茉莉酸甲酯可以短暫地提高AsA含量。L-半乳糖途徑中8個基因,除了BcVTC4,其余的基因均明顯受到茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)上調(diào)。BcVTCl,BcGME,BcVTC2和BcGLDH4個基因在茉莉酸甲酯處理后的3h即表現(xiàn)表達(dá)量上調(diào),這4個基因可能就是茉莉酸信號誘導(dǎo)AsA積累的幾個調(diào)控的靶基因。4.PMI是L-半乳糖途徑第一步反應(yīng)的催化酶。本研究用轉(zhuǎn)基因手段將不結(jié)球白菜中編碼PMI的基因BcPMI2在煙草中過量表達(dá),經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色,PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)基因植株8株；通過RT-PCR檢測,選取目的基因正常表達(dá)的P1和P2兩個轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行后續(xù)研究。結(jié)果表明BcPMI2在煙草中的過量表達(dá)不僅沒有提高煙草葉片的AsA含量,反而使正常生長狀態(tài)的煙草的葉片AsA含量降低,同時使葉片的可溶性糖含量降低。但BcPMI2在煙草中的過量表達(dá)提高了其葉片的過氧化氫耐受能力；轉(zhuǎn)基因煙草的葉盤經(jīng)過低濃度的過氧化氫處理3d,其AsA的含量高于同樣條件處理的野生型煙草葉盤。BcPMI2在煙草中的表達(dá)可能提高了L-半乳糖途徑合成AsA的潛力,從而在煙草組織遭