大白菜成花轉(zhuǎn)變基因篩選及內(nèi)源激素變化研究

大白菜成花轉(zhuǎn)變基因篩選及內(nèi)源激素變化研究大白菜(Brassicarapasubsp.pekinensis)品種間冬性強(qiáng)弱差異很大,弱冬性品種的先期抽薹是影響收益的重要原因,而強(qiáng)冬性品種則存在制種困難,因此,研究大白菜的成花機(jī)理具有非常重要的理論和實(shí)踐意義。盡管目前已有一些關(guān)于大白菜花期分子調(diào)控的研究報(bào)道,但與擬南芥相比,在成花分子機(jī)制上的研究深度和廣度仍有很大差距。大白菜基因組測序的完成和基因注釋的不斷完善以及高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用為大白菜成花機(jī)理的研究提供了一個(gè)新的手段。本研究以大白菜為試材,建立了最佳開花系統(tǒng);利用高通量測序技術(shù)對大白菜未經(jīng)低溫處理(CK1)、低溫處理后花芽即將分化(V1)、花芽分化1級(V2)的莖尖進(jìn)行測序,以篩選與成花相關(guān)的基因;克隆LFY同源基因并分析可變剪接類型及表達(dá)模式；分析成花各時(shí)期生長素、茉莉酸、赤霉素、玉米素和脫落酸的含量變化,明確各激素在成花過程中的作用,以期進(jìn)一步完善大白菜成花調(diào)控的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下：1.比較4個(gè)大白菜品系‘3#’、‘7#’、‘8#’和‘9#’在4℃低溫處理10d、20d和30d下的現(xiàn)蕾開花情況,發(fā)現(xiàn)隨著低溫處理時(shí)間的增加,各品系開始花芽分化、現(xiàn)蕾以及開花的時(shí)間均有所減少,對應(yīng)時(shí)期的葉片數(shù)也隨之減少。4個(gè)品系間的冬性差異顯著,‘9#’冬性最強(qiáng),‘8#’次之,‘3#’和‘7#’則較弱。綜合分析,‘3#’和‘7#’品系適宜作為大白菜成花機(jī)理研究的材料,低溫處理時(shí)間以20d為宜；如果選擇耐抽薹的品系進(jìn)行比較研究,可選用‘9#’,但要低溫處理30d以上才能使其通過春化。2.利用高通量測序技術(shù)對CK1、V1和V2這3個(gè)莖尖樣品進(jìn)行了測序,經(jīng)基因表達(dá)比較分析,CK1_vs_V1中共獲得1680個(gè)DEGs,其中780個(gè)上調(diào),900個(gè)下調(diào)。對DEGs進(jìn)行GO功能分析,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞組分注釋中,富集條目主要集中在葉綠體各組分;在分子功能注釋中,富集條目主要集中在各氧化還原酶活性上;在生物過程注釋中,富集條目主要集中在一些與成花有關(guān)的因素上,如藍(lán)光響應(yīng)、遠(yuǎn)紅光響應(yīng)、蔗糖響應(yīng)、水楊酸及茉莉酸介導(dǎo)的信號通路和MAPK級聯(lián)等。對DEGs進(jìn)行KEGG通路分析,結(jié)果表明黃酮類化合物和芥子油苷在成花過程中具有重要作用。3.將已經(jīng)公布的大白菜成花相關(guān)基因與表達(dá)譜比較,有10個(gè)基因差異表達(dá),且大部分基因的表達(dá)與預(yù)測一致,說明測序結(jié)果可信。有4個(gè)高差異表達(dá)基因的表達(dá)變化趨勢與成花功能描述一致,分別為促進(jìn)成花的Bra000180、Bra009813和抑制成花的Bra024350、Bra026653,預(yù)測它們在大白菜中也具有相似的功能,可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。4.克隆得到2條LFY同源基因序列,開放閱讀框分別為1248bp和1260bp,分別命名為BrpLFYl和BrpLFY2,并上傳序列至NCBI,GenBankaccessionnumber為KR190435和KR190436。經(jīng)可變剪接分析,發(fā)現(xiàn)二者是BrpLFY的不同可變剪接體,之所以相差12bp是因?yàn)樵诘诙怙@子處發(fā)生了可變5’端剪接,其中一個(gè)保留了12bp的第一內(nèi)含子序列。通過PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)在不同品系大白菜的不同發(fā)育時(shí)期,各組織中都幾乎只有BrpLFY2的表達(dá),這一結(jié)果與可變剪接表達(dá)量的分析結(jié)果一致,推測在大白菜成花過程中起主要作用的是BrpLFY1。o5.采用熒光定量PCR分析BrpLF喲時(shí)空表達(dá)模式,結(jié)果表明,BrpLFY基因在大白菜的各組織中均有表達(dá)。在莖尖生長點(diǎn)中的表達(dá)量隨著生長發(fā)育的進(jìn)行逐漸升高,在花芽分化開始時(shí)表達(dá)量驟升,并在5級時(shí)達(dá)到頂峰,而后開始下降,無論春季生長還是秋季種植冬儲過程均為如此,但在強(qiáng)冬性品種中的表達(dá)高峰更高,推測強(qiáng)冬性品種需要更高的BrpLF表達(dá)才能誘導(dǎo)成花。比較BrpLFY在不同組織器官中的表達(dá),在花芽分化5級時(shí),幼葉最高,成熟葉和生長點(diǎn)次之,根最低,另外在花蕾和花中的表達(dá)也較少。BrpLFY在花芽分化的幼葉和成熟葉中的表達(dá)量顯著高于其它組織,推測該基因在葉片的生長過程中也發(fā)揮了某些作用。6.采用ELISA法測定了‘7#’大白菜低溫處理組和對照組植株發(fā)育各時(shí)期莖尖生長點(diǎn)中IAA、JA、GA1+3、Z+ZR和ABA的含量,低溫處理組中各激素的含量變化結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi)較高含量的IAA、JA和GA1+3有利于大白菜成花轉(zhuǎn)變,而抽薹現(xiàn)蕾則需要較高含量的IAA、JA和Z+ZR,在花芽分化3級時(shí)各激素含量較低,說明在分化進(jìn)程中可能有一個(gè)短暫的停歇。此外,通過KEGG代謝通路分析,篩選到導(dǎo)致IAA、JA、Z+ZR和ABA在成花過程發(fā)生含量變化的主要基因。與對照植株相比,大白菜成花過程需要較高比值的GA1+3/IAA、Z+ZR/IAA、ABA/IAA、GA1+3/Z+ZR、ABA/GA1+3和ABA/Z+ZR。在低溫處理組中,一定范圍內(nèi)較高比值的GA1+3/IAA、Z+ZR/IAA、ABA/IAA、JA/IAA、JA/GA1+3、JA/Z+ZR和JA/ABA有利于成花轉(zhuǎn)變,而較低比值的JA/IAA、JA/GA1+3、JA/Z+ZR和JA/ABA有利于分化進(jìn)程,抽薹現(xiàn)蕾則需要較低比值的GA1+3/IA