丙泊酚抑制過氧化氫所致的脊髓星形膠質(zhì)細胞的損傷

丙泊酚抑制過氧化氫所致的脊髓星形膠質(zhì)細胞的損傷第一部分成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)目的：研究成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,AS)的體外培養(yǎng)、分離和純化的方法。為進一步研究星形膠質(zhì)細胞的生物學特性和脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)提供實驗模型。方法：采用原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞。無菌條件下取出成年大鼠胸段的脊髓,將脊髓剪碎用胰酶二次消化法,與機械吹打相結(jié)合使細胞分散,制成單細胞懸液,接種于無底物粘附的培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。利用差速黏附處理以去除成纖維細胞成分。培養(yǎng)10-14天,待細胞融合達90%左右時利用搖床純化細胞,舍棄含脫落細胞(小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元)的細胞懸液,接著培養(yǎng),待細胞長滿培養(yǎng)瓶底時傳代,觀察傳代細胞形態(tài)并對傳代后的星形膠質(zhì)細胞行免疫熒光鑒定。結(jié)果：運用差速粘附法、恒溫震蕩及傳代獲得了較高純度、形態(tài)典型的脊髓源性星形膠質(zhì)細胞。免疫細胞化學染色顯示：波形蛋白(vimentin)染色為陽性,陽性染色細胞高達100%,但膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)陽性染色細胞低。結(jié)論：體外培養(yǎng)的成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞可作為研究星形膠質(zhì)細胞模型,也為研究脊髓損傷時星形膠質(zhì)細胞的保護提供理想模型。培養(yǎng)的成年大鼠的星形膠質(zhì)細胞GFAP陽性染色率較低。第二部分丙泊酚抑制過氧化氫(H202)所致的脊髓星形膠質(zhì)細胞的損傷目的：研究丙泊酚對H202所致的脊髓星形膠質(zhì)細胞損傷的作用及其作用機理。方法：在大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)的基礎上,取第三代培養(yǎng)物用于以下實驗。使用四甲基偶氮鹽(MTT)法篩選適宜的過氧化氫濃度。在此濃度下觀察脂肪乳劑及不同濃度丙泊酚對星形膠質(zhì)細胞活力的影響。將星形膠質(zhì)細胞隨機分為①正常對照組：正常DMEM-F12培養(yǎng)基；②脂肪乳劑組；③H2O2損傷組：等終濃度的H2O2400μmol/L孵育30分鐘換液,繼續(xù)培養(yǎng)4h；④丙泊酚組：丙泊酚濃度為100μmo1/L,孵育4h。⑤丙泊酚+H2O2處理組：分別為25、50、100μmol/L3個濃度,預處理30min,再加入等終濃度的H2O2400μmol/L30分鐘換液,繼續(xù)培養(yǎng)4h；⑥脂肪乳劑+H2O2處理組：脂肪乳劑處理后,加入等終濃度的H2O2400μmol/L30分鐘換液,繼續(xù)培養(yǎng)4h。上述各組實驗完成后分別收集每組培養(yǎng)液和細胞,接著進行相關指標的檢測。于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變并拍照,用MTT法測各組細胞活性,比色法測MDA含量,ELISA法測LDH乳酸脫氫酶含量。結(jié)果：H2O2400μmol/L濃度具有明顯的細胞毒作用,細胞活力下降、LDH和MDA增加,和對照組相比較,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。和H202損傷組比較,三個濃度的丙泊酚+H202處理組細胞活力增加(P<0.05),明顯減少LDH漏出和抑制MDA增加,且呈劑量依賴性(P<0.05),有統(tǒng)計學意義。提示丙泊酚對H202所致的星形膠質(zhì)細胞損傷有拮抗作用,此作用呈劑量依賴性。脂肪乳劑無此作用。于倒置相差顯微鏡下表明,正常對照組星形膠質(zhì)細胞形態(tài)正常；H202損傷組細胞明顯腫脹,折光性增強,部分細胞脫落漂浮,胞質(zhì)變少、透明,胞核濃縮突出,細胞突起回縮；而給予丙泊酚處理30min后加入H202,星形膠質(zhì)細胞形態(tài)變化不大,細胞突起較H202損傷組清晰,胞體立體感較好。結(jié)論：H202損傷星形膠質(zhì)細胞,使細胞活力下降,LDH漏出量和MDA含