不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中微小RNA表達(dá)譜分析

不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中微小RNA表達(dá)譜分析不穩(wěn)定型心絞痛(unstableangina,UA)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的嚴(yán)重類型之一,是介于慢性穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)之間的中間臨床綜合征,它是AMI的前驅(qū)表現(xiàn),UA患者一年內(nèi)AMI發(fā)生率可達(dá)12%-13%,死亡率可達(dá)3%-18%。目前,UA的診斷主要基于臨床癥狀、心電圖和冠狀動脈造影術(shù),臨床上尚缺乏用于早期診斷的敏感性生化指標(biāo)。因此,尋找早期診斷分子標(biāo)志物,已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為20-24個核苷酸長度的非編碼單鏈RNA分子,已被證實參與心血管的發(fā)育,在動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNA能夠以微泡、蛋白復(fù)合體等形式穩(wěn)定存在于循環(huán)系統(tǒng),它的這種特性為心血管疾病的分子診斷提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。目前,芯片技術(shù)和qRT-PCR被廣泛應(yīng)用于血漿miRNA差異表達(dá)基因的篩選與驗證工作。本研究旨在通過ExiqonLNAmiRNA芯片技術(shù)和TaqMANstem-loopmiRNA定量PCR技術(shù),比較分析UA患者與健康人群血漿miRNA的表達(dá)譜,篩選UA組血漿中差異表達(dá)和變異穩(wěn)定的血漿miRNA分子,并進(jìn)行定量PCR的驗證。本研究技術(shù)路線：收集兩批UA患者和健康人群血漿樣本,分別用于血漿miRNA芯片檢測和qRT-PCR的驗證。通過芯片數(shù)據(jù)的前處理和數(shù)據(jù)分析,獲得UA患者血漿中差異表達(dá)的候選分子；其次,收集第二批健康人群血漿樣本,進(jìn)行血漿和細(xì)胞RNU6B表達(dá)分析；以RNU6B表達(dá)量為基線水平,進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)后處理,獲得可信度高的差異表達(dá)分子和內(nèi)參分子。第三,通過定量分析驗證UA患者差異表達(dá)候選基因miR-9-3p在UA患者以及健康體檢人群血漿中是否存在顯著差異,進(jìn)一步研究miR-9-3p對HepG2細(xì)胞膽固醇代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ATP-bindingCassetteTransporterA1,ABCA1)基因表達(dá)的影響,為miR-9-3p參與UA患者血脂調(diào)節(jié)提供佐證,以期為UA的早期臨床診斷提供潛在的分子標(biāo)記物。第一部分不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿miRNA表達(dá)譜特征分析目的：篩選UA患者血漿中差異表達(dá)miRNA分子。方法：本實驗收集了175例健康體檢人群血漿樣本和150例UA患者血漿樣本,分別制備成7個健康對照組血漿庫樣本和6個UA組血漿庫樣本。應(yīng)用ExiqonmiRCURYLNATMmiRNA芯片技術(shù),檢測血漿中miRNA的表達(dá)水平。采用統(tǒng)計學(xué)分析軟件R3.0.2中l(wèi)imma基因芯片分析程序包進(jìn)行miRNA芯片數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：1研究對象基本特征本實驗共入選UA患者150例(男性84名,女性66名),健康體檢人員175名(男性109名,女性66名),兩組間平均年齡分別為55±9歲、54±11歲?；咎卣鳎盒詣e、年齡、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)(Table1)。2血漿miRNA芯片數(shù)據(jù)獲取與分析2.1血漿miRNA芯片數(shù)據(jù)歸一化數(shù)據(jù)處理芯片數(shù)據(jù)歸一化后,消除了芯片間的熒光信號的整體偏差。如Fig.1紅色曲線所示,未經(jīng)VSN歸一化處理前,其平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差呈上升趨勢；如Fig.2紅色直線所示,經(jīng)VSN歸一化后,消除了芯片間信號的整體偏差。2.2血漿miRNA芯片數(shù)據(jù)的相關(guān)分析Spearman相關(guān)分析表明健康對照組和UA組血漿中miRNA表達(dá)譜具有可重復(fù)性,相關(guān)系數(shù)分析為0.87±0.08(Table2)和0.94±0.05(Table3)。2.3血漿miRNA芯片數(shù)據(jù)火山圖volannoplot技術(shù)分析表明,兩組間血漿中存在的大量差異表達(dá)miRNA分子(Fig3左上象限和右上象限)。2.4UA組血漿中miRNA的差異表達(dá)分析在UA患者血漿中,表達(dá)水平升高的miRNA共有207個(P<0.01),表達(dá)水平降低的miRNA共有134個(P<0.01)。小結(jié)：1通過ExiqonmiRNA芯片技術(shù),獲得健康對照組和UA組血漿miRNA表達(dá)譜。第二部分經(jīng)RNU6B血漿基線水平調(diào)整后UA患者血漿miRNA表達(dá)譜目的：通過RNU6B血漿基線水平調(diào)整,獲得可信度高的UA患者血漿miRNA表達(dá)譜。方法：本實驗選取健康體檢人員10例(男性5例,女性5例)為研究對象,應(yīng)用TaqMan探針miRNA實時熒光定量PCR技術(shù)檢測其血漿中RNU6B、miR-423-5p以及miR191-5p的表達(dá)水平,以HepG2細(xì)胞為研究對象,通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、實時熒光定量PCR檢測HepG2細(xì)胞RNU6B的表達(dá)量。實驗數(shù)據(jù)采用2-△CT進(jìn)行分析,兩個獨立樣本采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析,GraphPADPrism5.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1健康體檢人群基本特征臨床資料統(tǒng)計示：研究對象平均年齡為43±6歲、男女比例1：1、空腹血糖(FPG)為5.15±0.56mmoL/L、總膽固醇(TC)為4.95±0.77mmoL/L、甘油三酯(TG)為1.13±0.35mmoL/L、高密度脂蛋白(HDL-C)為1.04±0.32mmoL/L、低密度脂蛋白(LDL-C)為2.94±0.81mmoL/L(Table4)。2應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測10名健康體檢人員血漿RNU6B、miR-423-5p、miR-191-5p表達(dá)情況。2.1RNU6B表達(dá)水平的橫向比較血漿中RNU6B表達(dá)水平顯著低于HepG2細(xì)胞內(nèi)RNU6B表達(dá)水平(1.26×10-11vs2.04×10-8;P<0.001)(Table5,Fig.4)2.2血漿中RNU6B和miR-423-5p表達(dá)水平分析血漿中RNU6B表達(dá)水平顯著低于血漿miR-423-5p表達(dá)水平(1.26×10-11vs7.94×10-8;P<0.001)(Table6,Fig.4)2.3血漿中RNU6B和miR-191-5p表達(dá)水平分析血漿中RNU6B表達(dá)水平顯著低于血漿中miR-191-5p表達(dá)水平(1.26×10-11vs1.03×10-8;,P<0.001)(Table6、Fig.4)。2.4血漿中miR-508-3p和miR-509-5p的qRT-PCR的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)高于40Ct值,超出了qRT-PCR的檢出范圍,略低于RNU6B的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35-40。3RNU6B基線水平調(diào)整UA組與健康對照組血漿miRNA表達(dá)譜RNU6B基線調(diào)整前后,UA組和健康對照血漿表達(dá)譜特征發(fā)生顯著變化,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001;Table7,Fig.5)。RNU6B基線調(diào)整前,UA組較健康對照組血漿中共有207個miRNA分子的表達(dá)水平增高,134個miRNA分子的表達(dá)水平降低；基線調(diào)整后,表達(dá)水平升高的miRNA分子減少至124個miRNA(Table8),表達(dá)水平降低的niRNA分子減少至88個(Table9)。經(jīng)基線調(diào)整后,兩組間變異度穩(wěn)定的miRNA由938個減少至355個提示未經(jīng)基線調(diào)整的芯片數(shù)據(jù)含有大量沒有生物學(xué)意義的信號。Table10為變異度相對穩(wěn)定且呈高水平表達(dá)的30個miRNA分子,其中包括被推薦作為內(nèi)參使用的has-miR-423-5p。小結(jié)：1血漿中RNU6B的水平顯著性低于細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。2RNU6B基線調(diào)整后,UA組和健康對照血漿表達(dá)譜特征發(fā)生顯著變化,為miRNA芯片數(shù)據(jù)后處理分析提供了實驗依據(jù)。第三部分miR-9-3p在不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿表達(dá)水平分析及對ABCA1表達(dá)水平的影響目的：驗證miR-9-3p血漿表達(dá)水平在健康體檢人群以及UA患者是否存在顯著差異,判斷miR-9-3p對UA的診斷意義；從膽固醇代謝角度,探討其對HepG2細(xì)胞膽固醇代謝調(diào)節(jié)因子ABCA1轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白水平表達(dá)的影響。方法：本實驗選取UA患者30例,其中男性15例；女性15例；年齡、性別匹配的健康體檢人員28例,其中男性14例女性14例。采用mirVanamiRNA純化技術(shù)和TaqMan探針stem-loopmiRNA定量PCR技術(shù),檢測兩組血漿中miR-9-3p的表達(dá)水平。通過ROC曲線,判斷miR-9-3p對UA的診斷價值。以HepG2細(xì)胞為體外模型,通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、體外轉(zhuǎn)染技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)以及Westernblotting免疫印跡技術(shù),從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平,研究miR-9-3p對HepG2細(xì)胞ABCA1基因表達(dá)的影響。臨床計數(shù)資料使用n(%)表示,計量資料使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩組間數(shù)據(jù)比較計數(shù)變量采用卡方檢驗,計量數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗。實驗數(shù)據(jù)采用2-△CT法進(jìn)行分析,應(yīng)用中位數(shù)(四分位間距)來表示,’相對表達(dá)倍數(shù)用2-△Ct表示,兩組數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)t檢驗,應(yīng)用ROC曲線分析計算出AUC曲線下面積和95%可信區(qū)間。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,SPSS16.0以及GraphPADPrism5.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖。結(jié)果：1受試者人群的基本特征1.1為了進(jìn)行血漿miRNA差異表達(dá)驗證,收集健康體檢人群28例(男性14例；女性14例),平均年齡為56±8歲；UA組30例(男性15例；女性15例),平均年齡為56士10歲(Table11)。1.2UA組和對照組的基本資料比較：兩組間性別、年齡、FPG、TC、TG、HDL、LDL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(Table11).2UA組血漿中miR-9-3p的差異表達(dá)驗證UA組血漿中miR-9-3p的相對表達(dá)水平顯著低于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001,Fig.6;Table12)。ROC曲線分析顯示：ROC曲線下面積(AUC)值為0.839,P<0.0001,95%置信區(qū)間CI為：0.720-0.958(Fig7)。其AUC值介于0.7-0.9之間,說明miR-9-3p對UA的診斷具有一定的準(zhǔn)確性。3miR-9-3p對]HepG2細(xì)胞ABCA1基因表達(dá)的影響3.1應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測HepG2細(xì)胞miR-9-3pmimics轉(zhuǎn)染效率qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞中miR-9-3p表達(dá)水平較陰性對照組升高了22.58倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001;Fig.8)。3.2miR-9-3p對HepG2細(xì)胞ABCA1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響qRT-PCR結(jié)果顯示,兩組間ABCA1mRNA水平無顯著性差異(Fig.9;P=0.583)。3.