DB22-T 3353-2022 豬δ冠狀病毒檢測 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)法

11.220

41DB22 22/T

3353—2022豬δ冠狀病毒檢測 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）法

polymerase

amplification

detection

deltacoronavirus 吉林省市場監(jiān)督管理廳

DB22/T

2022前言本文件按照

GB/T

1.1-2020

DB22/T

2022豬δ冠狀病毒檢測 重組酶聚合酶擴(kuò)增法

GB

19489實(shí)驗(yàn)室

polymerase

DEPC焦碳酸二乙酯（Diethyl

MgAc

RT-RPA

PolymeraseAmplification）

RPA

開始反應(yīng)后，引物與重組酶組合形成復(fù)合物，在模板中尋找同源雙鏈

DNA

進(jìn)行定位，完成定位后發(fā)生鏈交換反應(yīng)，形成D-環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使

DNA

結(jié)合蛋白與單鏈DNA鏈綁定。隨后

DNA

聚合酶識別復(fù)

DB22/T

2022合物中重組酶解離引物后暴露的

端，進(jìn)行片段擴(kuò)增，形成兩條新的雙鏈DNA，如此循環(huán)，從而完成

6.1

RPA

1。

mol/L，pH

DEPC

水。

Marker

6.1.10

陽性對照為人工合成陽性質(zhì)粒，制備方法見附錄

A。6.1.11

6.2

L～10

L～20

L、20

L、200

L）。

DB22/T

2022

采集腸管組織樣品不少于

冷藏保存和

加入樣品

10%體積的

300

離心

10

9.2

使用無菌棉簽（6.2.1,7.5）

300

如不能立即檢測，應(yīng)保存于

-20

冰箱。

10.1

RNA。10.2cDNA

按照商品化試劑盒（6.1.4）說明書將

10.1

RNA

cDNA

冠狀病毒

RPA

2。同時設(shè)定陰性、陽性樣品對照。

DB22/T

2022

反應(yīng)體系置于

42

反應(yīng)時間為

25

min。

的擴(kuò)增產(chǎn)物及

Marker（6.1.9）分別加入凝膠孔（7.3），5

V/min

電泳

30

min（7.7,7.8），再取出

陽性對照出現(xiàn)目的

185

DB22/T

2022

gcttaactccgccatcaaacccgttgaaaaccatggctactggctgcgttacaccagacaaaagccaggtggtactccgattcctccatcctatgccttttattatacattaagcctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgaccccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacA.3

PDCoV

pET-28a

A.4

E.coli

入100

min

min；加

900

180

200

L，涂布于含抗生素的固體

LB

培養(yǎng)基，

h。

2O

L。

℃，5

min，72

min，35

滅菌牙簽取單個菌落與

PCR

10

37

倒置培養(yǎng)12

DB22/T

2022

10

L槍頭挑取

PCR

檢測有目的條帶菌落，打入

mL

含抗生素液體

LB

℃，180

16

h；取

mL

1000

g，1

質(zhì)粒提取試劑盒；