塵螨疫苗治療對(duì)呼吸道天然免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究

塵螨疫苗治療對(duì)呼吸道天然免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究目的:研究表明支氣管哮喘削弱肺部天然免疫,增加感染和定植風(fēng)險(xiǎn),塵螨疫苗特異性免疫治療對(duì)哮喘有較好的療效,而塵螨疫苗對(duì)肺部天然免疫的影響目前未見(jiàn)報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)研究塵螨疫苗對(duì)哮喘宿主抗感染能力的影響,并探討其可能的起效機(jī)制。方法:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):①4-6周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為PBS對(duì)照組、哮喘組和塵螨疫苗治療組。哮喘組和治療組通過(guò)3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型,治療組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù),對(duì)照組全程同步作PBS對(duì)照處理。末次激發(fā)24h后,測(cè)定小鼠氣道反應(yīng)性,肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù),肺組織病理學(xué)檢查,ELISA法測(cè)血清中抗原特異性IgE、IgG1和IgG2a水平。②4-6周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為PBS對(duì)照組、感染組、哮喘感染組和塵螨疫苗感染組。哮喘感染組和塵螨疫苗感染組通過(guò)3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型,塵螨疫苗感染組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù),感染組用PBS代替致敏、治療和激發(fā),感染組、哮喘感染組和塵螨疫苗感染組在末次激發(fā)后24h滴鼻感染綠膿桿菌,對(duì)照組全程同步作PBS對(duì)照處理。感染24h后測(cè)定小鼠肛溫,肺泡灌洗液中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和細(xì)菌含量觀察,肺組織病理學(xué)檢查,肺勻漿涂板測(cè)定細(xì)菌負(fù)荷量。③4-6周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為PBS對(duì)照組、哮喘組和塵螨疫苗治療組。哮喘組和治療組通過(guò)3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型,治療組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù),對(duì)照組全程同步作pbs對(duì)照處理。末次激發(fā)24h后elisa法測(cè)定小鼠肺泡灌洗液中抗菌肽cramp(cathelicidinrelatedantimicrobialpeptide)水平,免疫熒光法和實(shí)時(shí)熒光定量pcr法檢測(cè)肺組織中cramp蛋白和基因表達(dá),elisa法檢測(cè)肺泡灌洗液中il-4、ifn-γ、il-10和tgf-β1濃度,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)cyp27b1表達(dá)。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):①空白培養(yǎng)基、25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3、ifn-γ+25(oh)2vd3、il-10+25(oh)2vd3、tgf-β1、ifn-γ、il-10和1,25(oh)2vd3刺激人支氣管上皮細(xì)胞后,實(shí)時(shí)熒光定量pcr法測(cè)人抗菌肽camp(cathelicidinantimicrobialpeptide)表達(dá)。②不同濃度tgf-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞后,實(shí)時(shí)熒光定量pcr和免疫印跡法檢測(cè)cyp27b1蛋白和基因表達(dá)。③itra預(yù)處理后,經(jīng)25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3和tgf-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞,免疫印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人抗菌肽camp蛋白和基因表達(dá)。④itra預(yù)處理后,經(jīng)25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3和tgf-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞,再綠膿桿菌感染細(xì)胞,細(xì)胞勻漿涂板測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌含量。結(jié)果:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):①塵螨疫苗治療后小鼠penh值明顯低于哮喘組(p<0.01),肺泡灌洗液中各炎性細(xì)胞均減少(均p<0.01),血清中特異性ige和igg1比哮喘組降低(均p<0.01),igg2a高于哮喘組(p<0.01),肺組織氣道炎癥減輕。②經(jīng)塵螨疫苗治療的小鼠肛溫低于哮喘感染組(p<0.01),肺泡灌洗液中各炎性細(xì)胞均減少(均p<0.01),肺組織中和肺泡灌洗液中的細(xì)菌負(fù)荷均減少(均p<0.01),肺組織感染病變減輕。③塵螨疫苗治療后小鼠肺泡灌洗液中cramp含量增加(p<0.01),肺組織中cramp的mrna(p<0.01)和蛋白(p<0.01)表達(dá)均升高,肺泡灌洗液中IFN-γ、TGF-β1和IL-10表達(dá)增高(均P<0.01),IL-4表達(dá)降低(P<0.01),肺組織中CYP27b1表達(dá)增加。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):①TGF-β1+25(OH)2VD3組、25(OH)2VD3組和1,25(OH)2VD3組細(xì)胞CAMPmRNA表達(dá)上調(diào)(均P<0.01),且TGF-β1+25(OH)2VD3組比25(OH)2VD3組更高(P<0.05)。②濃度為0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的TGF-β1增加人支氣管上皮細(xì)胞CYP27b1蛋白和mRNA的表達(dá)(均P<0.01)。③ITRA降低TGF-β1+25(OH)2VD3對(duì)CAMP蛋白和mRNA的上調(diào)作用(均P<0.01)。④TGF-β1+25(OH)2VD3(P<0.01)和25(OH)2VD3(P<0.05)減少細(xì)胞內(nèi)入侵的細(xì)菌數(shù),并且TGF-β1+25(OH)2VD3組比25(OH)2VD3組(P<0.05)菌落數(shù)更少,而ITRA抑制了TGF-β1+25(OH)2VD3的作用(P<0.01)。結(jié)論:塵螨疫苗能有效減輕塵螨誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘