第十二章微生物發(fā)酵技術(shù)

第十二章微生物發(fā)酵技術(shù)第一節(jié)微生物發(fā)酵概論第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵的工藝流程第三節(jié)工業(yè)發(fā)酵的主要產(chǎn)品發(fā)酵工程是一門具有悠久歷史，又交融了現(xiàn)代科學(xué)的技術(shù)，是現(xiàn)代生物技術(shù)的組成部分。本章主要引見發(fā)酵工程的根本內(nèi)容和根本原理，重點(diǎn)引見了工業(yè)發(fā)酵的工藝流程,還引見了典型產(chǎn)品的發(fā)酵消費(fèi)工藝，如青霉素，谷氨酸和維生素C的消費(fèi)。第一節(jié)微生物發(fā)酵概論1857年巴斯德提出著名發(fā)酵實(shí)際：“一切發(fā)酵過程都是微生物作用的結(jié)果。〞1929年Flemming爵士發(fā)現(xiàn)了青霉素，添加一大類新產(chǎn)品-抗生素。20世紀(jì)40年代，以獲取細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物-抗生素為主要特征的抗生素工業(yè)成為微生物發(fā)酵工業(yè)技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。20世紀(jì)50年代，氨基酸發(fā)酵工業(yè)又成為微生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的又一個(gè)成員，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微生物的代謝進(jìn)展人工調(diào)理，這又使微生物技術(shù)進(jìn)了一步。20世紀(jì)60年代，微生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)又添加了酶制劑工業(yè)這一成員。20世紀(jì)70年代，為理處理由于人迅速增長(zhǎng)而帶來的糧食短缺問題，進(jìn)展了非碳水化合物替代碳水化合物的發(fā)酵，如利用石油化工原料進(jìn)展發(fā)酵消費(fèi)，培育單細(xì)胞蛋白，進(jìn)展污水處置，能源開發(fā)等。80年代以來，隨著重組DNA技術(shù)的開展，可以按人類社會(huì)的需求，定向培育出有用的菌株，這為微生物發(fā)酵技術(shù)引入了遺傳工程的技術(shù)，使微生物技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)新的階段。目前，人們把利用微生物在有氧或無氧形狀下生命活動(dòng)來制備微生物菌體或其它代謝產(chǎn)物的過程統(tǒng)稱為發(fā)酵。一、微生物發(fā)酵的概念及開展史1.微生物菌體發(fā)酵是以獲得具有某種用途的菌體為目的的發(fā)酵。用于面包制造的酵母發(fā)酵及用于人類或動(dòng)物食品的微生物菌體蛋青絲酵是比較傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵工業(yè)。新的菌體發(fā)酵可用來消費(fèi)藥用真菌，如香菇菌、依賴蟲蛹而生存的冬蟲夏草菌、與天麻共存的密環(huán)菌等藥用菌。2.微生物酶發(fā)酵酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中。由于微生物種類多、產(chǎn)酶的種類多、消費(fèi)容易和本錢低等特點(diǎn)，所以目前工業(yè)運(yùn)用的酶大多來自微生物發(fā)酵。3.微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物很多。在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所產(chǎn)生的產(chǎn)物，如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)和糖類等是菌體生長(zhǎng)繁衍所必需的，這些產(chǎn)物叫做初級(jí)代謝產(chǎn)物。在菌體生長(zhǎng)靜止期，某些菌體能合成一些具有特定功能的產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、植物生長(zhǎng)因子等。這些產(chǎn)物與菌體生長(zhǎng)繁衍無明顯關(guān)系，叫做次級(jí)代謝產(chǎn)物。二、微生物發(fā)酵的類型4.微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵微生物的轉(zhuǎn)化是利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，把一種化合物轉(zhuǎn)變成構(gòu)造相關(guān)的更有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物?？蛇M(jìn)展的轉(zhuǎn)化反響包括：脫氫反響、氧化反響、脫水反響、縮合反響、氨化反響、脫氨反響等。5.生物工程細(xì)胞的發(fā)酵是指利用生物工程技術(shù)所獲得的細(xì)胞，如DNA重組的“工程菌〞，細(xì)胞交融所得的“雜交〞細(xì)胞等進(jìn)展培育的新型發(fā)酵。此類發(fā)酵的產(chǎn)物多種多樣，如用基因工程菌消費(fèi)胰島素、干擾素等。優(yōu)良的微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的根底和關(guān)鍵，微生物資源非常豐富，廣泛分布于土壤、水和空氣中，尤以土壤中為最多1.從微生物分類學(xué)的角度把所需菌種分為：細(xì)菌類如短桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等；酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、漢遜酵母和假絲酵母等；霉菌如黃曲霉、紅曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放線菌如各種抗生素，鏈、慶大等。2.作為工業(yè)微生物發(fā)酵運(yùn)用的菌種，通常有以下特點(diǎn)：(1)具有穩(wěn)定的遺傳學(xué)特性。(2)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成對(duì)于基質(zhì)沒有嚴(yán)厲的要求。(3)生長(zhǎng)條件易于滿足。(4)具有較高的各種酶活力。〔5〕對(duì)于包含體，要求在細(xì)胞破碎是不易破碎，而在目的產(chǎn)物的分別提出時(shí)，那么易破碎。三、微生物發(fā)酵工業(yè)所用菌種1.微生物發(fā)酵過程是一個(gè)典型的化工過程。2.微生物發(fā)酵過程是一個(gè)典型的代謝控制發(fā)酵。3.微生物發(fā)酵工業(yè)又是一個(gè)有別于化工過程的一個(gè)工業(yè)。微生物發(fā)酵主要有以下幾個(gè)特征：〔1〕反響條件溫暖。通常由于微生物的生理特性，要求溫度為30℃～40℃、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放線菌的發(fā)酵和pH值中性偏堿性如細(xì)菌的發(fā)酵。〔2〕無菌發(fā)酵，整個(gè)反響過程要求無菌。培育基無菌、空氣無菌、補(bǔ)料和取樣要求無菌操作、某些工程菌，其尾氣也要求進(jìn)展無菌處置?！?〕非延續(xù)性消費(fèi)。微生物的生理特性決議了發(fā)酵過程的非延續(xù)性，大部分的工業(yè)發(fā)酵是以間歇操作為根底進(jìn)展的，目前可以實(shí)現(xiàn)延續(xù)化消費(fèi)的是啤酒的延續(xù)化消費(fèi)。四、微生物發(fā)酵的根本特征第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵的工藝流程生物發(fā)酵工藝多種多樣，但根本上包括菌種的選育、菌種培養(yǎng)基的配制、擴(kuò)展培育和接種、發(fā)酵過程下游處置即分別提純等幾個(gè)過程。找到適宜的菌種是發(fā)酵工程的前提。人們最初是從自然界尋找所需求的菌種，如谷氨酸發(fā)酵時(shí)常用菌有谷氨酸棒狀桿菌等。但這種方法得到的菌種，產(chǎn)量普通都比較低。20世紀(jì)40年代，微生物學(xué)家開場(chǎng)用紫外線、激光、化學(xué)誘變劑等處置菌種，使菌種產(chǎn)生突變，以挑選出符合要求的優(yōu)良菌種。隨著細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)的日益成熟，科學(xué)家開場(chǎng)構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌，用它們進(jìn)展發(fā)酵，甚至能消費(fèi)出普通微生物所不能消費(fèi)的產(chǎn)品。一、菌種的選育在大規(guī)模的發(fā)酵消費(fèi)中，需求將選育出的優(yōu)良菌種經(jīng)過多次擴(kuò)展培育，讓它們到達(dá)一定數(shù)量以后，再進(jìn)展接種。二、菌種培育基的配制培育基是選擇出的菌種生活的環(huán)境，對(duì)菌種有多方面的影響，所以致關(guān)重要。普通來說，培育基的配方要經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)才干確定。另外，發(fā)酵工程中所用的菌種多要求是純培育的，即整個(gè)發(fā)酵過程不能混有雜菌，否那么將導(dǎo)致產(chǎn)量大大下降，甚至得不到產(chǎn)品。例如，假設(shè)青霉素消費(fèi)過程中污染了雜菌，這些雜菌會(huì)分泌青霉素酶，將構(gòu)成的青霉素分解掉。因此，培育基和發(fā)酵設(shè)備都必需經(jīng)過嚴(yán)厲的滅菌。三、擴(kuò)展培育和接種發(fā)酵過程普通是在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)展的，發(fā)酵罐是一種圓柱形的容器，容量從幾升到幾百萬升，罐上除有通氣、攪拌、接種、加料、冷卻等安裝外，還有對(duì)溫度、pH、通氣量與轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件進(jìn)展檢測(cè)和控制的安裝。發(fā)酵過程中環(huán)境條件的變化，不僅會(huì)影響菌種的生長(zhǎng)繁衍，而且會(huì)影響菌種代謝產(chǎn)物的構(gòu)成。為了使發(fā)酵過程能順利進(jìn)展，要隨時(shí)取樣，檢測(cè)培育液中的細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度，同時(shí)還要及時(shí)為發(fā)酵菌提供必需的營(yíng)養(yǎng)，并嚴(yán)厲控制溫度、pH、溶氧、通氣量與轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件。四、發(fā)酵過程發(fā)酵終了后，要對(duì)發(fā)酵液或生物細(xì)胞進(jìn)展分別和提取精制，將發(fā)酵產(chǎn)物制成符合要求的產(chǎn)品。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的要求不同，分別提純的方法也相應(yīng)有些區(qū)別。利用發(fā)酵工程消費(fèi)的產(chǎn)品有菌種代謝產(chǎn)物和菌種本身〔如酵母菌和細(xì)菌〕兩大類，假設(shè)產(chǎn)品是菌種，分別方法普通是經(jīng)過過濾、沉淀從培育液中分別出；假設(shè)產(chǎn)品是代謝產(chǎn)物，那么采用蒸餾、萃取、離子交換等方法提取。分別提純后的產(chǎn)品，還要經(jīng)過質(zhì)量檢查合格后，才干成為正式產(chǎn)品。五、分別提純工藝流程第三節(jié)工業(yè)發(fā)酵的主要產(chǎn)品一、抗生素發(fā)酵消費(fèi)抗生素是生物體在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物。這類有機(jī)物質(zhì)能在低濃度下抑制或殺滅活細(xì)胞，這種作用又有很強(qiáng)的選擇性?？股刂饕梦⑸锇l(fā)酵法消費(fèi)，少數(shù)抗生素也可用化學(xué)方法合成，人們還對(duì)天然得到的抗牛素進(jìn)展生化或化學(xué)改造，使其具有更優(yōu)越的性能，這樣得到的抗生素叫半合成抗生素，其數(shù)目已到達(dá)兩萬多種。抗生素不僅廣泛用于臨床醫(yī)療，而且曾經(jīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧及環(huán)保等領(lǐng)域。青霉素是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的—種抗生素，1928年為英國(guó)人A.Fleming發(fā)現(xiàn)，40年代投入工業(yè)消費(fèi)。在二戰(zhàn)期間立刻大顯身手，它能有效控制傷口的細(xì)菌感染，挽救了數(shù)百萬戰(zhàn)爭(zhēng)中受傷者的性命。我們就以青霉素為例簡(jiǎn)單引見抗生素的發(fā)酵消費(fèi)過程。(一)青霉素發(fā)酵消費(fèi)菌株最初由弗萊明分別的點(diǎn)青霉，只能產(chǎn)生2U／ml的青霉素。目前全世界用于消費(fèi)青霉素的高產(chǎn)菌株，大都由菌株WisQl76(一種產(chǎn)黃青霉)經(jīng)不同改良途徑得到。70年代前育種采用誘變和隨機(jī)挑選方法，后來由于原生質(zhì)體交融技術(shù)、基因克隆技術(shù)等現(xiàn)代育種技術(shù)的運(yùn)用，青霉素工業(yè)發(fā)酵消費(fèi)程度已達(dá)85000U／ml以上。青霉素消費(fèi)菌株普通在真空冷凍枯燥形狀下保管其分生孢子，也可以用甘油或乳糖溶劑作懸浮劑，在－70度冰箱或液氮中保管孢子懸浮液和營(yíng)養(yǎng)菌絲體。(二)青霉素發(fā)酵消費(fèi)培育基1、碳源目前普遍采用淀粉經(jīng)酶水解的葡萄糖糖化液進(jìn)展流加。2、氮源可選用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩質(zhì)粉，并補(bǔ)加無機(jī)氮源。3、前體苯乙酸或苯乙酰胺，由于它們對(duì)青霉菌有一定毒性，故一次參與量不能大于0．1％，并采用多次參與方式。4、無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類，鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)厲控制發(fā)酵波中鐵含量在30ug／ml以下。(三)青霉素發(fā)酵工藝1.種子制備種子制備階段以消費(fèi)豐富的孢子〔斜面和大米孢子培育〕或大量強(qiáng)壯的菌絲體〔種子罐〕為目的。2.發(fā)酵培育影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的要素有環(huán)境要素，如pH值、溫度、溶氧飽合度、碳氮組份含量等；有生理變量要素，包括菌絲濃度、菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲形狀等，對(duì)它們都要進(jìn)展嚴(yán)厲控制。3.發(fā)酵后處置(1)過濾：采用鼓式真空過濾器，過濾前加去乳化劑并降溫(2)提煉用溶媒萃取法。將發(fā)酵濾液酸化至pH2，加1/3體積的醋酸丁酯，混合后以碟片式離心機(jī)分別，得一次BA提取液。然后以1.3%～1.9%NaHCO3在pH6.8～7.1條件下將青霉素從BA中提取到緩沖液中。再調(diào)pH至2.0，將青霉素從緩沖液再次轉(zhuǎn)入到BA中，方法同上，二次BA提取液。(3)脫色在二次BA提取液中加活性炭150一300g／10億單位，脫色、過濾。(4)結(jié)晶用丁醇共沸結(jié)晶法。將二次BA萃取以0.5mol/LNaOH液萃取，調(diào)pH至6.4～6.8，得青霉素鈉鹽水濃縮液。加3～4倍體積的丁醇，在16～26℃，5～10mmHg下真空蒸餾，將水與丁醇共沸物蒸出，并隨時(shí)補(bǔ)加丁醇。當(dāng)濃縮到原來水濃縮體積，蒸出餾分中含水達(dá)2％～4％時(shí)，即停頓蒸餾。

青霉素鈉鹽結(jié)晶析出，過濾，將晶體洗滌后進(jìn)展枯燥得廢品?？稍?0℃，20mmHg真空中烘16h，然后磨粉、裝桶。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的根本單位，是人體及動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。谷氨酸是一種重要的氨基酸。我們就以谷氨酸的發(fā)酵消費(fèi)為例簡(jiǎn)單引見一下氨基酸的發(fā)酵消費(fèi)。(一)谷氨酸發(fā)酵消費(fèi)的菌種谷氨酸酵消費(fèi)菌種主要有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬的細(xì)菌。除節(jié)桿菌外，其他三屬中有許多菌種適用于糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵。這些細(xì)菌都是需氧微生物，都需求以生物素為生長(zhǎng)因子。我國(guó)谷氨酸發(fā)酵消費(fèi)所用菌種有北京棒狀桿菌AS1299、鈍齒棒狀桿菌AS1542、HU7251及7338、B9等。這些菌株的斜面培育普通采用由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉等組成，pH為7.0～7.2的瓊脂培育基，32℃培育24h，冰箱保管備用。二、氨基酸發(fā)酵消費(fèi)(二)谷氨酸發(fā)酵消費(fèi)的原料制備谷氨酸發(fā)酵消費(fèi)以淀粉水解糖為原料。淀粉水解糖的制備普通有酸水解法和酶水解法兩種。國(guó)內(nèi)常用的是淀粉酸水解工藝。(三)菌種擴(kuò)展培育〔1〕一級(jí)種子培育采用液體培育基，由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳等組成，pH為6.5～6.8；三角瓶?jī)?nèi)32℃振蕩培育12h，貯于4℃冰箱備用?！?〕二級(jí)種子培育培育基除用水解糖替代葡萄糖外，其他與一級(jí)種子培育基相仿。種子罐內(nèi)32℃通氣攪拌培育7～10h，即可移種或冷卻至10℃?zhèn)溆谩?四)谷氨酸發(fā)酵消費(fèi)發(fā)酵初期，菌體生長(zhǎng)遲滯，約2～4h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝旺盛，糖耗快，這時(shí)必需流加尿素以供應(yīng)氮源并調(diào)理培育液的pH值至7.5～8.0，同時(shí)堅(jiān)持溫度為30～32℃。本階段主要是菌體生長(zhǎng)，幾乎不產(chǎn)酸，菌體內(nèi)生物素含量由豐富轉(zhuǎn)為貧乏，時(shí)間約12h。隨后轉(zhuǎn)入谷氨酸合成階段，此時(shí)菌體濃度根本不變，糖與尿素分解后產(chǎn)生的α-酮戊二酸和氨主要用來合成谷氨酸。這一階段應(yīng)及時(shí)流加尿素以提供氨及維持谷氨酸合成最適pH7.2～7.4，需大量通氣，并將溫度提高到谷氨酸合成最適溫度34～37℃。發(fā)酵后期，菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑停铚p少流加尿素量。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，谷氨酸濃度不再添加時(shí)，及時(shí)放罐，發(fā)酵周期約為30h。(五)谷氨酸提取谷氨酸提取有等電點(diǎn)法、離子交換法、金屬鹽沉淀法、鹽酸鹽法和電滲析法，以及將上述方法結(jié)合運(yùn)用的方法。國(guó)內(nèi)多采用的是等電點(diǎn)法。三、維生素發(fā)酵消費(fèi)維生素C又稱抗壞血酸〔ascorbicacid〕，能參與人體內(nèi)多種代謝過程，使組織產(chǎn)生膠原質(zhì)，影響毛細(xì)血管的浸透性及血漿的凝固，刺激人體造血功能，加強(qiáng)機(jī)體的免疫力。另外，由于它具有較強(qiáng)的復(fù)原才干，可作為抗氧化劑，已在醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面獲得廣泛運(yùn)用。我國(guó)利用一種微生物將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L古龍酸，再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化消費(fèi)維生素C，稱為兩步發(fā)酵工藝。此法使產(chǎn)品產(chǎn)量得到大幅度提高，限于篇幅，僅簡(jiǎn)單引見如下：第一步發(fā)