發(fā)酵分析-凝膠電泳

課堂練習(xí)薄層層析用硅膠，有硅膠G、硅膠H、硅膠GF254、硅膠HF360等不同標(biāo)號，它們分別表示什么含義？化合物A在薄層板上從原點遷移7.6cm，溶劑前沿距原點距離16.2cm：（1）計算化合物A的Rf值。（2）在相同的薄層系統(tǒng)中，溶劑前沿距原點距離14.3cm，化合物A的斑點應(yīng)在此薄層板上的何處？現(xiàn)有兩種性質(zhì)相似的組分A和B，共存同一溶液中，用薄層色譜分離時，它們的比移值分別是0.45，0.63。欲使分離后兩斑點中心間的距離為2cm，此薄板應(yīng)為多長？0.476.72cm12/28/20231電泳帶電粒子在電場力作用下向著所帶電荷相反的方向泳動的現(xiàn)象叫電泳。凝膠電泳電泳的用途？12/28/20232聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE）12/28/20233原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(N，N，N

，N-tetramethyl

ethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。12/28/20234丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺12/28/20235凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)由丙烯酰胺單體聚合成長鏈，長鏈之間用N,N-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成多孔狀結(jié)構(gòu)。孔的大小可以用雙丙烯酰胺的濃度來調(diào)節(jié)。濃度增大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙（孔徑）減小。形

成

凝

膠

的

反

應(yīng)

式12/28/20236C=2.6%C=5%凝膠濃度/T%分子量范圍/kDa凝膠濃度/T%分子量范圍/kDa530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150聚丙烯酰胺凝膠濃度與蛋白質(zhì)分子量的關(guān)系C：Bis占兩者的百分含量（交聯(lián)度）T：Acr和Bis在凝膠中的總濃度12/28/20237PAGE分離蛋白質(zhì)的依據(jù)

不同的蛋白質(zhì)分子，由于其側(cè)鏈可解離基團(tuán)的種類和數(shù)量、分子質(zhì)量、空間三維結(jié)構(gòu)都有所不同，所以：等電點（pI）不同，同一pH條件，所帶電荷種類、數(shù)量不同大小、形狀不同12/28/20238蛋白質(zhì)分子在電場中的泳動速度常常用遷移率來表示定義：蛋白質(zhì)分子在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度

m==

V=遷移速度；E=電場強(qiáng)度；η=介質(zhì)粘度在同一介質(zhì)中電泳，m只與蛋白分子自身大小和形狀（r）、所帶電荷數(shù)量（Q）相關(guān)利用蛋白質(zhì)混合物中各蛋白的遷移率不同（蛋白性質(zhì)差異造成），而達(dá)到分離的效果V—E

6πrη_____

Q遷移率12/28/202396種蛋白質(zhì)混合物的電泳結(jié)果圖12/28/202310影響蛋白質(zhì)電泳速度的外在因素溶液pH

決定蛋白質(zhì)所帶電荷的電性和電量

溶液的離子強(qiáng)度

越低，遷移越快；一般應(yīng)在0.01~0.2mol/L之間電場強(qiáng)度電滲現(xiàn)象電泳支持介質(zhì)溫度12/28/202311影響蛋白質(zhì)電泳速度的內(nèi)在因素蛋白質(zhì)分子所帶電荷的電性和電量電性決定電泳方向；電量越大，遷移速度越快蛋白質(zhì)分子的大小和形狀分子質(zhì)量越小、形狀越接近球形，在電場中遷移速度越快12/28/202312SDS1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。

他們發(fā)現(xiàn)樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑（SDS）以后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。12/28/20231312/28/202314--------------------------------------12/28/202315SDS是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，去多肽折疊。巰基乙醇或DTT是還原劑，能打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。此時SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合物，大約每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子?；驹?2/28/20231612/28/202317

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15000～200000之間時，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下列方程：常數(shù)斜率遷移率通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量。12/28/202318

電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子在前，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。

不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動示意圖混合樣品帶孔膠

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子12/28/20231912/28/202320SDS分類

SDS按照緩沖液pH值和凝膠孔徑差異分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：連續(xù)系統(tǒng)：由電極緩沖液和分離膠組成。電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)：由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度均不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。12/28/202321聚丙烯酰胺凝膠電泳常用的是平板電泳儀。裝置見下圖連續(xù)(a)與不連續(xù)(b)平板凝膠電泳示意圖12/28/202322

電泳儀

12/28/202323垂直板式電泳槽平板式電泳槽轉(zhuǎn)移電泳槽雙向電泳槽12/28/202324垂直柱式電泳槽（盤狀電泳槽）12/28/20232512/28/202326凝膠干燥器12/28/202327凝膠成像系統(tǒng)12/28/202328SDS－PAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量12/28/202329實驗過程凝膠制備樣品處理與加樣電泳剝膠與固定染色與脫色安裝電泳槽12/28/202330實驗過程流程圖12/28/202331考馬斯亮藍(lán)G-250染料酸性溶液中與蛋白質(zhì)疏水區(qū)結(jié)合465nm棕紅色藍(lán)色595nm考馬斯亮藍(lán)染色法在酸性條件下，蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭R-250結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物（595nm處最大吸收峰），藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系12/28/202332銀染法原理：銀染時蛋白條帶上的AgNO3被還原成金屬Ag，沉積在蛋白條帶上而顯色顯色方法分為化學(xué)顯色和光顯色靈敏度達(dá)2ng/條帶12/28/202333結(jié)果分析相對遷移率的計算

相對遷移率mR=蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)標(biāo)準(zhǔn)蛋白在SDS-凝膠上的示意圖12/28/202334標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以每條Marker帶的相對遷移率為橫坐標(biāo)，相應(yīng)分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分子量相對遷移率12/28/202335未知蛋白質(zhì)樣品分子量的測算

計算未知蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對應(yīng)的縱坐標(biāo)，即可得該樣品的分子量。12/28/202336等電聚焦電泳IsoelectricFocusingElectrophoresis，IEF12/28/202337等電聚焦等電聚焦（IEF)

：利用一種特殊的緩沖液（兩性電解質(zhì)）在聚丙烯酰胺凝膠上制造一個pH梯度，電泳時，蛋白遷移到其等電點就不帶電荷而停止電泳，通過該方法分離蛋白的方法。12/28/202338蛋白質(zhì)分子在不同pH下的解離狀態(tài)

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

12/28/202339等電聚焦電泳（IEF）原理利用不同蛋白質(zhì)的等電點的不同而使其在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)等電聚焦過程中，蛋白質(zhì)分子在一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳，結(jié)果導(dǎo)致每種蛋白質(zhì)分子遷移到等于其pI的pH處（此時蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零），最終聚集形成一個很窄的蛋白區(qū)帶

12/28/202340+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH1012/28/20234112/28/202342pH梯度的形成

載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物,在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個連續(xù)的pH梯度。

12/28/202343Ampholyte化學(xué)結(jié)構(gòu)式Pharmalyte化學(xué)結(jié)構(gòu)式常用的兩種載體兩性電解質(zhì)12/28/202344

沒通電時的變化所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電，只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團(tuán)數(shù)目相等，凈電荷為零。12/28/202345引入電場時的變化12/28/202346電泳結(jié)束后的變化12/28/20234712/28/202348等點聚焦電泳的應(yīng)用

1.分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽①區(qū)分人血清蛋白②測出異常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆區(qū)帶的檢測2.測定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽12/28/202349一、蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生背景1.20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時代。隨著人類基因組全序列測定，生命科學(xué)跨入了后基因組時代。2.因mRNA的表達(dá)情況不能直接反應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。3.蛋白質(zhì)有自身特有的活動規(guī)律，如動態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)形成、代謝等，均無法從基因組水平上的研究獲知。蛋白質(zhì)構(gòu)象更難于只靠DNA序列來解釋。4.蛋白質(zhì)才能動態(tài)反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。20世紀(jì)90年代中期，國際上萌發(fā)了蛋白質(zhì)組學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)和雙向電泳技術(shù)12/28/202350HumanProteomeOrganization,HUPO蛋白質(zhì)組：闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的存在方式（修飾形式），研究其結(jié)構(gòu)、功能、定量和相互作用等12/28/202351蛋白質(zhì)組研究策略蛋白質(zhì)1蛋白質(zhì)2蛋白質(zhì)3。。。組織、細(xì)胞等蛋白質(zhì)分離雙向凝膠電泳分離色譜分離切取蛋白條帶或蛋白點蛋白混合物多肽混合物MS/MS數(shù)據(jù)庫比對酶解質(zhì)譜鑒定12/28/202352目前唯一能分離上千種蛋白的技術(shù)蛋白質(zhì)分離首選技術(shù)：

雙向凝膠電泳技術(shù)小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞系K562人腎臟細(xì)胞12/28/202353雙向電泳（2-dimensionElectrophoresis，2-DE）是樣品經(jīng)第一向電泳后，再在垂直方向上進(jìn)行第二向其他類型電泳的電泳方式。目前的雙向電泳一般是：第一向為等電聚焦（IEF），第二向為SDS2-DE使得分離分辨率大大提高，獲得的信息也明顯增多，是目前電泳技術(shù)中分辨率最高、信息獲得最多的技術(shù)，常用于分析復(fù)雜樣品及繪制蛋白質(zhì)組圖譜，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)12/28/20235412/28/202355二維電泳基本操作流程樣品準(zhǔn)備等電聚焦（IEF,第一維）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS,第二維)染色圖像分析質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)庫分析，鑒定蛋白12/28/202356考染法銀染法熒光染料法放射自顯影染色12/28/202357凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠圖像的掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫的建立12/28/20235812/28/202359相對遷移率相對分子量對數(shù)12/28/2023606種蛋白質(zhì)混合物的電泳結(jié)果圖12/28/202361瓊脂糖凝膠電泳帶有電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)—瓊脂糖凝膠和緩沖液，根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。負(fù)在電場中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極12/28/20236212/28/202363天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。12/28/202364

瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。

D-半乳糖3，6-脫水-L-半乳糖12/28/20236512/28/202366瓊脂糖凝膠的特點

（一）優(yōu)點1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸