發(fā)酵分析-色譜分析概述

色譜分析第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的特點(diǎn)、分類和作用

混合物最有效的分離、分析方法。俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過(guò)程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過(guò)程。其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動(dòng)相。碳酸鈣（固定相）色素混合液石油醚

(流動(dòng)相）1906年，Tsweet

發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜柱色帶植物色素分離圖示色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無(wú)機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。不足之處：

被分離組分的定性較為困難。色譜法的分類1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分類流動(dòng)相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜超臨界流體色譜法——流動(dòng)相為超臨界流體色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機(jī)制分類平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細(xì)管柱色譜

分配色譜吸附色譜離子交換色譜空間排阻色譜毛細(xì)管電詠法毛細(xì)管電色譜法毛細(xì)管電泳二、色譜過(guò)程、分離原理及特點(diǎn)㈠色譜過(guò)程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過(guò)程以吸附色譜為例見圖示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測(cè)組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離圖示分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強(qiáng)的組分后流出back㈡色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來(lái)衡量㈢色譜分離特點(diǎn)

1．不同組分通過(guò)色譜柱時(shí)的遷移速度不等→提供了分離的可能性

2．各組分沿柱子擴(kuò)散分布→峰寬→不利于不同組分分離三、色譜流出曲線與術(shù)語(yǔ)1.基線

無(wú)試樣通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。2.保留值

（1）時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；

死時(shí)間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時(shí)間；

調(diào)整保留時(shí)間（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=

tM×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

3.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來(lái)衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(

)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354

（3）峰底寬(Wb)：Wb=4

四、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)分配系數(shù)K(平衡常數(shù))：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動(dòng)相中的濃度比（色譜過(guò)程的相平衡參數(shù)）注：K為熱力學(xué)常數(shù)與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動(dòng)相性質(zhì)及溫度有關(guān)實(shí)驗(yàn)條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)五、色譜定性與定量方法1.

色譜定性分析(1)利用保留值及其規(guī)律定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)。利用純物質(zhì)對(duì)照定性利用文獻(xiàn)值對(duì)照定性純物質(zhì)對(duì)照定性實(shí)現(xiàn)方法利用保留時(shí)間定性

用相對(duì)保留值定性

用已知物增加峰高法定性

文獻(xiàn)值對(duì)照定性分析（GC）實(shí)現(xiàn)方法測(cè)定保留指數(shù)I

優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關(guān)。缺點(diǎn)：對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。適用范圍：適用于簡(jiǎn)單混合物，無(wú)需純物質(zhì)。（2）與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定:

外標(biāo)法外標(biāo)法也稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。特點(diǎn)及要求：外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高操作條件變化對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大對(duì)進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析

內(nèi)標(biāo)法原理：利用被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物校正因子的比值不變來(lái)進(jìn)行定量的。首先用被測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，求得校正因子比值：然后，樣品中加入內(nèi)標(biāo)物，再由它和樣品的峰面積來(lái)計(jì)算：

fis＝fi/fs－內(nèi)標(biāo)物與被測(cè)組份校正因子的比值；

mi－被測(cè)組份i的含量；ms－加入內(nèi)標(biāo)物的量；As－內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai－組份i的峰面積；(a)內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大。(b)每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：（a）試樣中不含有該物質(zhì)；（b）與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近；（c）不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（d）出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分附近，且無(wú)組分峰響。內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)與外標(biāo)法比較：1.外標(biāo)法：2.內(nèi)標(biāo)法：可以推導(dǎo)出：思考題色譜分離的原理及過(guò)程。第二節(jié)薄層層析（Thin-layerchromatography）1、基本原理薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種

一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同組分的吸附力不一樣，不同組分在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合樣品隨著展開劑的移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過(guò)吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來(lái)）Thin-LayerChromatography:ATwo-ComponentMixtureMorepolar!Lesspolar!solvent

frontoriginmixturesolvent

frontcomponent

Bcomponent

Aoriginsolvent

frontcomponent

Bcomponent

AoriginIncreasingDevelopmentTimeThin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadecimalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplacesThin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis固定相：氧化鋁Acidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH+-Al-O-Basic:-Al-O-硅膠吸附薄層層析吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠

硅膠：表達(dá)式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基（－Si－OH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)：

①硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。②硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。③硅膠的活化溫度通常為105℃－110℃，不能過(guò)高。2、操作步驟

—薄層板的制備

1、調(diào)漿稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調(diào)成均勻的糊狀。

2、涂布取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

3、干燥將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。

4、活化

70℃烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時(shí)取出。展開劑的選擇1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個(gè)點(diǎn)。每個(gè)樣品間相距約1cm。2、取樣：用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細(xì)管柱高5cm。3、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣毛細(xì)管輕輕接觸薄層表面點(diǎn)樣。加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過(guò)2mm。

AlaArg

GlyMix輕觸疾起操作步驟—點(diǎn)樣

(a)點(diǎn)狀點(diǎn)樣(b)條狀點(diǎn)樣(c)頸部點(diǎn)樣(d)溝槽點(diǎn)樣半自動(dòng)點(diǎn)樣儀手動(dòng)點(diǎn)樣器操作步驟—

展層、顯色AlaArg

GlyMix

將薄層板點(diǎn)樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應(yīng)低于點(diǎn)樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時(shí)，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風(fēng)吹干或在85℃下烘干，即可顯出各層斑點(diǎn)。物理顯色含有共軛雙鍵的有機(jī)物質(zhì)能吸收紫外光，將分離后的薄層板置于紫外燈下，組分薄層呈現(xiàn)暗色斑；如果采用硅腔GF(或其它含有熒光指示劑的吸附劑)鋪成的薄層，在紫外光照射下，整個(gè)薄層呈顯黃綠色熒光，斑點(diǎn)部分呈現(xiàn)暗色，更為明顯。利用蒸氣熏顯色時(shí)，常用的試劑有固體碘、濃氨水、液體溴。進(jìn)行顯色時(shí)，把這些易揮發(fā)的試劑放置在密閉容器內(nèi)（例如標(biāo)本瓶、標(biāo)本缸、干燥器等），使它們的蒸氣充滿整個(gè)容器，將已展開并已揮發(fā)去溶劑的薄層板放入其中，使之顯色?；瘜W(xué)顯色的方式通常有直接噴霧法和浸漬法兩種。

化學(xué)顯色常用的顯色劑劑大致可以分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。通用顯色劑：對(duì)未知化合物的檢測(cè)，可以考慮先用通用顯色劑。這種顯色劑是利用它與被測(cè)組分的氧化還原反應(yīng)、脫水反應(yīng)及酸堿反應(yīng)等而顯色的，常用的有50％的硫酸溶液、酸堿指示劑溶液、5％磷鉬酸乙醇溶液、熒光顯色劑等。：

結(jié)果計(jì)算Rf=斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離溶劑前緣至原點(diǎn)距離

小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，計(jì)算出它們的Ｒｆ值。

根據(jù)Ｒｆ值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。薄層色譜掃描儀

定義：紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的一種微量分離方法。載體——層析紙（濾紙）；固定相——濾紙上的吸濕水分；流動(dòng)相——有機(jī)溶劑（展開劑）。紙色譜思考題簡(jiǎn)述TLC的操作步驟。概念：離子交換分離法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所發(fā)生的交換反應(yīng)進(jìn)行分離的方法。（二）離子交換色譜儀器設(shè)備簡(jiǎn)介離子交換全套裝置離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)-網(wǎng)絡(luò)骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、環(huán)氧系離子交換樹脂結(jié)構(gòu)骨架：接有功能基團(tuán)，本身是惰性功能基團(tuán)：連接在骨架上，可與相反離子結(jié)合待交換分子：在吸附階段可與活性離子交換，與骨架上的功能基團(tuán)結(jié)合活性離子：與功能基團(tuán)所帶電荷相反的可移動(dòng)的離子活性離子為陽(yáng)離子，稱陽(yáng)離子交換樹脂，與陽(yáng)離子發(fā)生交換活性離子為陰離子，稱陰離子交換樹脂，與陰離子發(fā)生交換基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子商品名纖維素—O—CH2——COO-

·Na+CM-纖維素纖維素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纖維素聚苯乙烯—————SO3-·

Na+732陽(yáng)離子樹脂

聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717陰離子樹脂聚苯乙烯磺酸型陽(yáng)離子交換樹脂的制備離子交換樹脂的形狀結(jié)構(gòu)示意圖帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶