大豆Gm2-MMP啟動子分離及Gm2-MMP互作蛋白篩選

大豆Gm2-MMP啟動子分離及Gm2-MMP互作蛋白篩選大豆[Glycinemax(L.)Merr.]是世界上重要的糧食作物,是植物蛋白的主要來源。南方春大豆區(qū)是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)之一,該地區(qū)大豆在種子生理成熟期(R6期-R7期)常會遭遇高溫高濕的天氣,種子極易發(fā)生田間劣變,導(dǎo)致種子活力下降?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)屬于金屬內(nèi)肽酶中的MA簇M10家族,EC3.4.24亞類,是一類鋅鈣依賴型的蛋白酶。廣泛分布于動物、植物體內(nèi),能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。植物MMPs可能參與發(fā)育調(diào)控、免疫應(yīng)答及非生物逆境脅迫響應(yīng)等多個方面。本課題組前期的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明高溫高濕脅迫后田間劣變抗性品種湘豆3號中MMPs蛋白呈上調(diào)表達(dá)。本研究在此基礎(chǔ)上,以種子田間劣變抗性品種湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號為材料開展以下研究:(1)Gm2-MMP啟動子的分離,并對其順式作用元件進(jìn)行分析;(2)Gm2-MMP互作蛋白的篩選與鑒定;(3)Gm-PM31的生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位;(4)Gm-M31的組織表達(dá)特異性分析及高溫高濕脅迫下Gm-PM31的表達(dá)特性分析。以期為進(jìn)一步研究MMP在參與大豆生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫等方面的生物學(xué)功能提供幫助。主要研究結(jié)果如下:1.在Gm2-MMP基因5’上游1596bp內(nèi)分離到了該基因的啟動子序列,其序列中存在熱激響應(yīng)(CCAATBOX1)、脫水黃化誘導(dǎo)(ACGTATERD1)、干旱響應(yīng)(ABRELATERD1)和光調(diào)控(IBOXCORE)等順式作用元件;通過對Gm2-MMP基因啟動子5’端不同缺失片段驅(qū)動的GUS基因在煙草葉片中的瞬時表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),-359bp～-223bp對該啟動子的高溫高濕誘導(dǎo)活性是必須的。2.以Gm2-MMP蛋白為誘餌對高溫高濕脅迫下抗種子田間劣變春大豆種子膜蛋白酵母雙雜交文庫進(jìn)行篩選,初步獲得39個可能與Gm2-MMP互作的蛋白,分別為:球蛋白、油體蛋白、種子成熟蛋白、白蛋白、胰蛋白酶抑制劑、蔗糖結(jié)合蛋白、水通道蛋白、富甘氦酸類蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、MYB轉(zhuǎn)錄因子、60S核糖體蛋白、鈣連接蛋白、脫水素蛋白、Ca2+結(jié)合EF手型蛋白以及未知功能蛋白。3.Gm-PM31生物信息學(xué)分析表明,Gm-PM31與豆科相關(guān)蛋白親緣關(guān)系較近,且具典型的ACD-ScHsp26-like和IbpA結(jié)構(gòu)域。對Gm-PM31編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,其定位于高爾基體。通過酵母雙雜交和BiFC實驗對Gm2-MMP與Gm-PM31在體內(nèi)的互作進(jìn)行了驗證。4.qRT-PCR結(jié)果表明,Gm-PM31在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號中均表現(xiàn)為在成熟種子中表達(dá)量最高,在成熟葉片、老葉及幼莢中有少量表達(dá),其他組織中表達(dá)量很低甚至不表達(dá);在大豆種子發(fā)育過程中Gm-PM31的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢,并在開花后第45天表達(dá)量達(dá)到最大值。在種子生理成熟期進(jìn)行高溫高濕脅迫后,在寧鎮(zhèn)1號種子中,與對照相比,Gm-PM31在脅