定量PCR方法及數(shù)據(jù)分析

定量PCR原理、應(yīng)用及數(shù)據(jù)分析ZJW原理：PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。反應(yīng)分為變性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（extension）三步。PCR擴(kuò)增理論方程：起點定量與終點定量：起點的DNA量為“天然”的含量，更有意義；終點的DNA量為經(jīng)過PCR過程“加工”的量，存在部分“失真”。（終點定量存在更大的誤差）定量PCR：通過實時監(jiān)測PCR每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號，來實現(xiàn)對起始模板進(jìn)行定量或者定性的分析化學(xué)原理：熒光染料嵌合法,探針法SYBRGreenI（不飽和型），EvaGreen/LCGreen（飽和型），與dsDNA小溝部位嵌合，具有綠色激發(fā)波長。游離時不發(fā)光。缺點：需用meltingcurve檢測產(chǎn)物特異性。探針法：可用于多重PCR及基因分型

TaqMan探針：檢測積累熒光

一種寡核苷酸探針,探針兩端各錨定一個基團(tuán)，淬滅劑則在3‘末端。

Taqman探針識別并結(jié)合特定的靶序列；探針完整時，報告基團(tuán)R發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)Q吸收；在進(jìn)行延伸反應(yīng)時,Taq聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離,發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生?；€：擴(kuò)增曲線中的水平部分閾值（Threshold):指擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢測界限。Ct值：從基數(shù)到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)定量PCR數(shù)學(xué)原理定量PCR技術(shù)的應(yīng)用定性分析：病毒病原菌檢測、生物品種鑒定、SNP分析等、基因突變分析等絕對定量：基因拷貝數(shù)分析，病毒病原菌定量分析等相對定量：mRNA表達(dá)分析，siRNA表達(dá)分析等定量PCR實驗流程目標(biāo)基因的查找、比對引物、探針的設(shè)計與合成反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化數(shù)據(jù)分析定量PCR引物設(shè)計的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。④引物的退火溫度要高，一般要在60℃以上。內(nèi)參基因的選擇：內(nèi)參：用于去除不同樣本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率差異對目標(biāo)基因表達(dá)的影響。穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的組織和細(xì)胞中（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞），而且其表達(dá)量無顯著差異；高度或中度表達(dá)，排除太高或太低表達(dá)；表達(dá)水平與細(xì)胞周期、細(xì)胞是否活化無關(guān)，且不受任何外源性和內(nèi)源性因素的影響。常見幾種內(nèi)參基因的優(yōu)缺點：GAPDH：在不同癌組織（包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌）中表達(dá)升高，在不同個體間、妊娠期間以及細(xì)胞周期的不同階段，以及多種因素刺激下（包括低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等）表達(dá)存在差異；β-actin：細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時表達(dá)水平增加；18SrRNA:rRNA合成的調(diào)節(jié)獨立于mRNA。rRNA不包括PolyA尾，在以O(shè)ligodT作為引物的cDNA合成中不能被轉(zhuǎn)錄。rRNA高豐度表達(dá)，遠(yuǎn)高于目標(biāo)基因，較其他內(nèi)參基因穩(wěn)定，且受RNA降解的影響比較小。反應(yīng)體系的配制

（25ul體系）組分加量模板cDNA2uL10uM引物F/R各0.5uL2xSYBRGreenmix12.5uLddH2O9.5uL熔解曲線絕對定量：從熒光強(qiáng)度到拷貝數(shù)相對定量的數(shù)據(jù)分析

(2-ΔΔCt法/comparativeCtmethod)Livak,K.Jetal."Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method."目標(biāo)基因表達(dá)量（處理組/非處理組）的差異Livak,K.Jetal."Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method."Livak,K.Jetal."Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method."Livak,K.Jetal."Analysisofre