藥物分析11第十一章抗生素類藥物

第十一章抗生素類藥物的分析〔AnalysisofAntibioticsDrugs〕第一節(jié)概述第二節(jié)

-內(nèi)酰胺類抗生素第三節(jié)氨基糖苷類抗生素第四節(jié)四環(huán)素類抗生素1編輯ppt第一節(jié)概述一、抗生素藥物的特點(diǎn)：抗生素〔antibiotics〕是指“在卑微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異性抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱〞。1．低化學(xué)純度－同系物多、異構(gòu)體多、降解物多；2．活性組分易發(fā)生變異;活性組分的變異性－生產(chǎn)過程中條件的變化；3．穩(wěn)定性差－不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。2編輯ppt二、抗生素類藥物的質(zhì)量分析QualityAnalysis/QualityControl-QA/QC鑒別試驗(yàn)Identification㈠1．顯色反響——特殊基團(tuán)的反響〔β-內(nèi)酰胺類的羥肟酸鐵反響、麥牙酚反響、坂口反響〕2．光譜法——特征吸收〔IR、UV〕3．色譜法——保存行為〔標(biāo)準(zhǔn)對照法〕4．生物學(xué)方法——抗菌能力〔抗生素滅活前后的抑制菌能力〕3編輯ppt㈡檢查〔Investigation〕1、影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的指標(biāo)——結(jié)晶性、水份、酸堿度等2、有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)檢查——澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、重金屬等3、與臨床平安性密切相關(guān)的指標(biāo)——異常毒性、熱原、降壓物質(zhì)等4、其他檢查——“懸浮時(shí)間與抽針試驗(yàn)〞、其他共存組分4編輯ppt含量測定或效價(jià)測定(Potency)Determination㈢Potency:是指每ml或每mg中含有某種抗生素有效成分的多少，以u或μg表示。以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標(biāo)來判斷效價(jià)的一種方法。如：1mg的青霉素鈉為1670單位；1mg的慶大霉素定為590單位?！惨陨蟽H為理論效價(jià)，實(shí)驗(yàn)樣品低于該理論效價(jià)〕5編輯ppt1、微生物檢定法稀釋法－配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細(xì)菌，經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度測得最低抑菌濃度(MIC)。比濁法－標(biāo)準(zhǔn)曲線法。管碟瓊脂擴(kuò)散法－抑菌圈。標(biāo)準(zhǔn)曲線法或者標(biāo)準(zhǔn)對照法，以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，含藥濃度為縱坐標(biāo)。方法種類6編輯ppt靈敏度高、需用量少適用范圍廣－純品、不純品、的和新的可一次測定同類型抗生素的總效價(jià)－無需別離純化，與臨床的應(yīng)用要求一致操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力誤差較大培養(yǎng)時(shí)間長是結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多組分抗生素效價(jià)測定的首先方法特點(diǎn)缺點(diǎn)7編輯ppt2、物理化學(xué)法High-performanceliquidchromatography〔HPLC〕Liquidchromatography-Massspectrometry〔LC-MS〕UV容量法準(zhǔn)確可靠、專屬性高、操作簡單、省時(shí)、樣品用量少1、對結(jié)構(gòu)或提純的抗生素2、需要標(biāo)準(zhǔn)品對照儀器分析方法1、不一定代表生物效價(jià)2、易受雜質(zhì)干擾缺點(diǎn)適用范圍優(yōu)點(diǎn)8編輯pptβ－內(nèi)酰胺類抗生素－青霉素、頭孢菌素類氨基糖苷類抗生素－鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等四環(huán)素類抗生素－四環(huán)素、金霉素、土霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素－紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素等多烯大環(huán)類抗生素－制菌霉素、兩性霉素B多肽類抗生素－放線菌素、多黏菌素苯烴胺類抗生素－氯霉素

蒽環(huán)類－阿霉素、紫紅霉素等三、抗生素類藥物的分類(Classification〕9編輯ppt四、抗生素的生產(chǎn)與雜質(zhì)來源〔一〕抗生素的生產(chǎn)主要采用兩種方法：〔1〕生物合成〔發(fā)酵〕：生物包括微生物〔真菌、放線菌、細(xì)菌等〕、植物、動物?！仓饕a(chǎn)方法〕〔2〕化學(xué)合成或半合成方法制取〔少數(shù)生產(chǎn)方法〕〔二〕抗生素雜質(zhì)的主要來源：〔1〕生產(chǎn)過程中帶入〔2〕貯藏過程中產(chǎn)生10編輯ppt第二節(jié)-內(nèi)酰胺類抗生素

〔-LactamAntibiotics〕*1.青霉素類〔PC〕*2.頭孢菌素類〔CEP〕3.頭霉素4.-內(nèi)酰胺酶抑制劑5.其他11編輯ppt一、化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：1、分子結(jié)構(gòu)的母核由A環(huán)〔-內(nèi)酰胺環(huán)〕與B環(huán)〔氫化噻唑環(huán)式氫化噻嗪環(huán)〕駢合而成：青霉素族〔PC〕的母核：6-氨基青霉烷酸〔6-aminopenicillanicacid，簡稱6-APA〕；頭孢菌素〔CEP〕族的母核：7-氨基頭孢菌烷酸〔7-aminocephalosporanicacid，簡稱7-ACA〕。12編輯ppt青霉素族〔PC〕頭孢菌素族〔CEP〕β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)構(gòu)6-APA7-ACA13編輯pptβ-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)構(gòu)例如：青霉素類頭孢菌素類碳青霉烯類頭霉素類單環(huán)β-內(nèi)酰胺類14編輯ppt理化性質(zhì)〔1〕酸性與溶解度；〔2〕旋光性；〔3〕紫外吸收光譜；〔4〕-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性15編輯ppt酸性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)與堿金屬(Na+、K+)成鹽

〔一〕羧基易溶于水

Na16編輯ppt〔二〕手性C頭孢菌素類C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡17編輯ppt

〔三〕共軛體系頭孢菌素類

母核有共軛體系

青霉素類

母核無明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV18編輯ppt〔四〕β–內(nèi)酰胺環(huán)水溶液

不穩(wěn)定

枯燥純潔穩(wěn)定不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解

放置環(huán)境青霉素類

某些氧化劑酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效19編輯ppt二、鑒別反響1、TLC法2、HPLC法比較Rf和斑點(diǎn)顏色供試品對照品相同條件Rt比較供試品對照品相同條件〔一〕色譜法20編輯ppt〔二〕光譜法1．紅外光譜〔IR〕吸收波數(shù)cm-1歸屬波數(shù)cm-1歸屬3470，3180酚羥基和酰胺γO-H，N-H1585，1400羧基離子γCOO-3100~2600胺鹽γN+-H1620苯環(huán)γC=C1780Β-內(nèi)酰胺γC=O1250酚羥基γC-O1690仲酰胺γC=O21編輯pptβ-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺115251680-=cm、VOC117501800-=cm~VOCNHV=13300-cmCOOHV-114101600-cm、羧基22編輯ppt3180cm-1

N-Hβ–內(nèi)酰胺

C=O1780cm-13470cm-1

O-H1690cm-1仲酰胺

C=O1250cm-1

C-O以阿莫西林IR圖譜為例23編輯ppt2、UV法樣品、分解產(chǎn)物

①利用最大吸收波長鑒定法；②水解產(chǎn)物的最大吸收波長鑒定法。頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+苯唑青霉烯酸苯唑西林鈉+HnmA339?A,Emin,max,,%cm11λ光譜圖λ24編輯ppt25編輯ppt〔三〕呈色反響1、羥肟酸鐵反響β-內(nèi)酰胺類NaOH呈色Fe3+/3H+羥肟酸衍生物H2NOH·HClβ-內(nèi)酰胺類H2NOH

HClNaOH，C2H5OH26編輯ppt2.類似肽鍵的反響——茚三酮反響

α-氨基藍(lán)紫色

-氨基茚三酮

27編輯ppt3.雙縮脲反響似肽鍵（開環(huán)分解）

-內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫色4.與重氮苯磺酸反響頭孢哌酮酚羥基橙黃色重氮苯磺酸--56OHHC〔偶合〕28編輯ppt5.與變色酸-硫酸反響活潑“-CH2-〞青霉素阿莫西林氨芐西林變色酸顯色△（分解）29編輯ppt1.K+、Na+的火焰反響〔四〕各種鹽的反響

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉+Ac→↓白

K+30編輯ppt三、特殊雜質(zhì)的檢查本類抗生素的特殊雜質(zhì)主要有高分子聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測定雜質(zhì)的吸收度來控制雜質(zhì)量的。藥物檢查工程檢查方法

頭孢他啶聚合物HPLC法

頭孢曲松鈉

頭孢哌酮鈉

頭孢噻肟鈉

頭孢呋辛酯有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體HPLC法

頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)反相TLC法

青霉素鉀〔鈉〕吸收度紫外分光光度法

31編輯ppt〔一〕聚合物例如：以頭孢他啶中頭孢他啶聚合物的測定。固定相：葡聚糖凝膠G-10〔40-120μm〕

流動相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液

流動相B：0.01%十二烷基硫酸鈉

對照品溶液：頭孢他啶對照品100μg/ml1〕系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：N不低于900，拖尾因子0.75-1.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%。

2〕測定方法：以外標(biāo)法計(jì)算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得超過0.3%32編輯ppt〔二〕有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體例如1：頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

固定相：ODS

流動相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇〔62:38〕

1〕頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體的制備：頭孢呋辛酯對照品+流動相頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體。

2〕系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：各異構(gòu)體之間的R>1.5，以頭孢呋辛酯A異構(gòu)體計(jì)算n>1500。33編輯ppt3〕異構(gòu)體：

相對保存時(shí)間1--被測物

2--標(biāo)準(zhǔn)物異構(gòu)體相對保存時(shí)間判斷B異構(gòu)體0.85供試液譜圖中A異構(gòu)體的峰面積A異構(gòu)體1.0與A、B異構(gòu)體峰面積和之比應(yīng)為0.48~0.55。異構(gòu)體A異構(gòu)體B頭孢呋辛34編輯ppt例如2：頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查-反相TLC法

固定相：活化后的硅膠G板置5%〔V/V〕正十四烷的正己烷溶液中，展至頂部，涼干展開劑:0.1M枸櫞酸-0.2M磷酸氫二鈉-丙酮〔120：80：3〕

供試液：本品50mg/ml

對照液〔1〕:本品0.5mg/ml

對照液〔2〕:α-苯甘氨酸0.5mg/ml

對照液〔3〕:7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸0.5mg/ml結(jié)果判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對照液〔2〕〔3〕位置相同上所的斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深；如顯其他雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對照液〔1〕所顯的主斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深。35編輯ppt〔三〕吸收度：ChP中常用來控制本類抗生素的雜質(zhì)含量。例如：青霉素鈉〔鉀〕的吸收度檢查：供試液：1.80mg/ml，

結(jié)果判斷：A280不得大于0.10〔控制雜質(zhì)量〕；A264應(yīng)在0.80-0.88〔檢查藥物量〕。36編輯ppt本類藥物多采用理化測定方法進(jìn)行含量測定，Ch.P收載的主要方法有：HPLC法、電位配位滴定法、可見–紫外分光光度法、碘量法等。2005年版Ch.P中收載的抗生素品種共有284個(gè)，其中使用了HPLC法的品種有205個(gè)，約占70%。用于檢測的工程有：鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢查、組分測定、含量均勻度和含量測定。四、含量測定-儀器分析法

37編輯ppt〔一〕高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保存行為的不同而實(shí)現(xiàn)高效別離，并與標(biāo)準(zhǔn)品相對照，而對其進(jìn)行定量的一種方法。優(yōu)化色譜分析條件〔1〕Column-CNODSC18C8-Ben〔2〕mobilephase/flowrate〔3〕columntemperature〔4〕detectionwavelength〔5〕workstationsamplepreparation38編輯ppt實(shí)驗(yàn)本卷須知〔1〕色譜峰要到達(dá)較好的別離－基線別離(baseseparation)〔2〕需要標(biāo)準(zhǔn)品對照，用外標(biāo)法定量〔3〕可同時(shí)測定多個(gè)組分的含量〔4〕需要排除制劑中輔料等雜質(zhì)對測定的干擾SelectivityLinearity-CalibrationcurvePrecisionandaccuracyRecoveryStability39編輯ppt內(nèi)標(biāo)法＋校正因子外標(biāo)法方法快速、高效、靈敏專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好一法多用〔鑒別、檢查、含測〕特點(diǎn)HPLC法的定量方法和特點(diǎn)40編輯ppt第三節(jié)氨基糖苷類抗生素

〔aminoglycosidesantibiotics〕【藥理作用】

氨基糖苷類抗生素可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。其殺菌作用具有如下特點(diǎn)：

1.殺菌作用呈濃度依賴性。

2.僅對需氧菌有效，尤其對需氧革蘭氏陰性桿菌的抗菌作用強(qiáng)。

3.具有明顯的抗生素后效應(yīng)。

4.具有初次接觸效應(yīng)。

5.在堿性環(huán)境中抗菌活性增強(qiáng)。

41編輯ppt一、共性

1.抗菌譜相似主要抗G-桿菌，某些對銅綠假單胞菌、結(jié)核桿菌有效2.抗菌機(jī)制相似殺菌藥

①多環(huán)節(jié)阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)合成始動復(fù)合物形成肽鏈延伸肽鏈終止

②通過離子吸附作用，增加膜通透性42編輯ppt3.理化性質(zhì)相似呈堿性〔極性大〕，其鹽易溶于水〔脂溶性差〕，性質(zhì)穩(wěn)定。4.體內(nèi)過程相似口服難吸收，可作胃腸消毒;肌肉或靜脈注射用于全身感染；蛋白結(jié)合率低，主要分布于細(xì)胞外液〔胸、腹腔液及心包液濃度較高〕原形經(jīng)腎排泄〔但腎功損害者,屢次口服仍可中毒〕43編輯ppt化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)已多元醇為苷元，與氨基縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素〔aminoglycosidesantibiotics〕。這類抗生素主要有：鏈霉素、慶大霉素、新霉素及巴龍霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等，它們的抗菌譜和化學(xué)性質(zhì)都有共同之處。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)44編輯ppt天然類鏈霉素(streptomycin)

慶大霉素(gentamicin)

卡那霉素(kanamycin)妥布霉素(tobramycin)

西索米星(sisomicin) 新霉素(neomycin)

小諾米星(micronomicin)大觀霉素(spectinomycin)半合成類阿米卡星 (amikacin)奈替米星(netilmicin)45編輯ppt1.鏈霉素〔strepotomycin即鏈霉素A〕的結(jié)構(gòu)為一分子鏈霉胍和一分子鏈霉雙糖結(jié)合而成的堿性苷。結(jié)構(gòu)如下：苷元糖鏈霉雙糖胺鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

〔一〕化學(xué)結(jié)構(gòu)46編輯ppt臨床應(yīng)用①鼠疫、兔熱?、诓际蠗U菌病 ③感染性心內(nèi)膜炎 ④抗結(jié)核’不良反響①第八對腦神經(jīng)損害②過敏性休克③神經(jīng)肌肉阻滯④口周、面部、四肢麻木47編輯ppt巴龍霉素D-葡萄糖胺+脫氧鏈霉胺+D-核糖+巴龍霉糖巴龍胺苷元巴龍二糖胺糖

48編輯ppt2.慶大霉素〔gentamycin〕是由絳紅糖胺、脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮合而成的苷。它是慶大霉素C復(fù)合物，尚有少量次要成分〔如慶大霉素A1、A2、A3、A4、B、B1、X……〕。主要成分C1、C2、C1a及C2a的結(jié)構(gòu)如下：49編輯ppt慶大霉素C復(fù)合物慶大霉素C1

R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2

R=R2=H

R1=CH3

慶大霉素C1a

R、R1、R2=H

慶大霉素C2a

R=CH3R1=R2=H

慶大霉素C2b

R=R1=HR2=CH350編輯ppt抗菌作用

G+：金葡菌、白喉?xiàng)U菌、炭疽桿菌

G-：球菌、桿菌、銅綠假單胞菌臨床應(yīng)用

可與羧芐西林合用

①嚴(yán)重G-桿菌感染

②銅綠假單胞菌感染如心內(nèi)膜炎

③原因未明的G-菌混合感染

④口服用于腸道感染或術(shù)前準(zhǔn)備不良反響腎毒性前庭功能損害51編輯ppt多與硫酸成鹽鏈霉素3個(gè)慶大霉素5個(gè)堿性中心堿性〔一〕水溶性溶解性（二）〔二〕性質(zhì)52編輯ppt鏈霉素

pH5～7.5慶大霉素pH2～12

穩(wěn)定穩(wěn)定性（四）UV（三）53編輯ppt二、

鑒別

茚三酮反應(yīng)（一）△羥基胺結(jié)構(gòu)54編輯ppt（二）Molisch反應(yīng)（糖類反應(yīng)）

藍(lán)紫色慶大霉素（六碳糖）鏈霉素（五碳糖）α-萘酚H???+糠醛羥甲基糠醛蒽酮紅紫色55編輯pptN-甲基葡萄糖胺反響〔三〕〔Elson-Morgan反響〕乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色甲基葡萄糖胺慶大霉素鏈霉素水解-N56編輯ppt鏈霉糖特有反響麥芽酚反響〔四〕H+分子重排鏈霉糖鏈霉素????-OH麥芽酚紫紅色????+3Fe57編輯ppt8-羥基喹啉α-萘酚（或α-萘酚）橙紅羥基喹啉鏈霉胍鏈霉素次溴酸鈉?????-????-8OH鏈霉胍特有反響坂口反響〔五〕58編輯ppt〔六〕硫酸鹽反響〔七〕色譜法1．薄層色譜法：ChP、USP〔25〕、BP〔2000〕采用該法對硫酸慶大霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龍霉素、鏈霉素等進(jìn)行鑒別。多以硅膠為薄層板，氯仿-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸氣為顯色劑。H+白ˉ????4-24+2BaSOSOBa〔八〕UV法慶大霉素?zé)oUV吸收nmmax230=λ鏈霉素59編輯ppt〔八〕HPLC法BP〔2000〕采用HPLC法鑒別慶大霉素，根據(jù)組分檢查項(xiàng)下色譜圖，比較供試液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖，慶大霉素C1、C2、C1a、C2a四組分的保存時(shí)間應(yīng)一致。60編輯ppt三、特殊雜質(zhì)檢查及組分分析〔一〕鏈霉素中鏈霉素B的檢查薄層板：硅膠G薄層。展開劑：甲苯-冰醋酸-甲醇〔50：25：25〕方法：以D-甘露醇為對照品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照法比較斑點(diǎn)的顏色?！捕衬翁婷仔侵杏嘘P(guān)物質(zhì)檢查各國藥典已對該類局部抗生素采用色譜法〔HPLC或TLC法〕進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的檢查。如硫酸奈替米星中有關(guān)物質(zhì)檢查采用標(biāo)準(zhǔn)品對照法，比較斑點(diǎn)顏色的深淺。61編輯ppt〔三〕慶大霉素C組分測定中、英、美、日等國藥典均規(guī)定控制慶大霉素中C1、C2、C1a、C2a各組分的相對百分含量。均采用HPLC法測定慶大霉素C各組分的含量。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水-冰醋酸-甲醇〔25：5：70〕配制的0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液為流動相；檢測波長為330nm；理論塔板數(shù)按C2組分計(jì)算應(yīng)不低于2000。C2a和C2峰的別離度應(yīng)符合要求。重復(fù)進(jìn)樣，其相對標(biāo)準(zhǔn)差〔RSD〕應(yīng)小于2.0%。以內(nèi)標(biāo)-峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對含量。圖譜62編輯ppt討論：〔1〕柱效：以C2峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不得低于2000?！?〕流動相：流動相極性應(yīng)適當(dāng)控制〔適當(dāng)調(diào)節(jié)甲醇比例〕：極性過強(qiáng)，出峰快，別離不佳；流動相極性過弱，出峰太慢?！?〕衍生化試劑與衍生物的穩(wěn)定性；〔4〕離子對試劑濃度影響；(四)硫酸鹽測定本類抗生素臨床應(yīng)用的主要為硫酸鹽，各國藥典規(guī)定EDTA絡(luò)合滴定法測定硫酸鹽，作為組分分析。63編輯ppt四、含量測定本類抗生素的效價(jià)測定目前各國藥典主要采用微生物檢定法。近年來國內(nèi)外又有各種免疫法、色譜法等定量分析方法。由于本類抗生素多數(shù)無紫外吸收，不能直接用紫外或熒光檢測器，需進(jìn)行柱前或柱后衍生化，采用的衍生化試劑有鄰苯二醛、1、2-萘醌-4-磺酸、2、4、6-三硝基磺酸、1-氟-2、4-二硝基苯、9-芴甲基氯甲酸酯、茚三酮等。64編輯ppt例如豬組織中慶大霉素和新霉素的HPLC法 色譜條件：HypersilBDSC18分析柱；乙腈-水〔85：15〕為流動相；流速1.0ml/min；熒光檢測器，λex=260nm，λem=315nm。樣品處理：取樣品〔肝、腎、肌肉〕適量，加磷酸鹽緩沖液〔Ph=7.4〕，室溫孵育1h，然后加三氯乙酸，勻漿30s，于4℃下離心〔3500r/min〕15min，將上清液移置另一試管中，加離子對試劑〔已烷磺酸鈉溶液〕。再經(jīng)固相柱提取純化，用乙腈-0.02mol/L已烷磺酸鈉〔55：45〕洗脫。洗脫液與9-芴甲基氯甲酸酯〔FMOC-Cl〕混合，進(jìn)行衍生化反響，15min后加甘氨酸中止反響，取適量進(jìn)樣測定。圖譜65編輯ppt結(jié)果與討論：用FMOC-Cl衍生化可獲得強(qiáng)熒光的衍生物，在pH8.0的條件下反響，衍生物可穩(wěn)定在12h。見圖11-7。測得慶大霉素各組分和新霉素的提取回收率在75%-86%之間；日內(nèi)、日間RSD小于10%；檢測限分別為0.05μg/g和0.1μg/g〔S/N=5〕；定量限為檢測限2倍。在0.1μg/g-1.0μg/g范圍內(nèi)，被測組分濃度與響應(yīng)值之間呈良好的線性關(guān)系，r>0.999。66編輯ppt第四節(jié)四環(huán)素類抗生素

〔tetracyclinesantibiotics〕這類抗生素有四個(gè)環(huán)構(gòu)成，故統(tǒng)稱為四環(huán)素類抗生素。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)結(jié)構(gòu)中各取代基R、R′、R″及R的不同構(gòu)成各種四環(huán)素類抗生素。常見結(jié)構(gòu)如下：67編輯ppt2．性質(zhì)〔1〕酸堿性與溶解度：顯弱堿性和顯弱酸性，是兩性化合物?！?〕旋光性：具有不對稱碳原子，因此有旋光性；〔3〕紫外吸收和熒光性質(zhì)：〔4〕與金屬離子形成配位化合物：〔5〕穩(wěn)定性：四環(huán)素類抗生素對各種氧化劑〔包括空氣中氧在內(nèi)〕、酸、堿都是不穩(wěn)定的。本類抗生素具有氫化駢四苯的共同根本母核，均是化學(xué)兩性物質(zhì)，可與酸、堿成鹽，但在堿性水溶液易降解，在酸性水溶液穩(wěn)定，一般以鹽酸鹽應(yīng)用于臨床。68編輯pptA差向異構(gòu)化性質(zhì)：四環(huán)素類抗生素在弱酸性〔pH2.0-6.0〕溶液中會發(fā)生差向異構(gòu)化。差向四環(huán)素四環(huán)素69編輯pptB降解性質(zhì)：酸性降解，在酸性條件下〔pH<2〕生成脫水四環(huán)素〔anhydrotetracycline，ATC〕。反響式如下：四環(huán)素脫水四環(huán)素70編輯ppt堿性降解：在堿性溶液中生成無活性的異構(gòu)體。反響如下：異四環(huán)素類抗生素四環(huán)素類抗生素71編輯ppt二、鑒別試驗(yàn)

1．濃硫酸反響；2．三氯化鐵反響；3．薄層色譜法：應(yīng)用例如鹽酸土霉素的鑒別薄層板的制備：硅藻土EDTA-2Na溶液-甘油〔95：5〕為粘合劑；展開劑：取4%EDTA-2Na溶液〔pH7.0〕5ml，加至醋酸乙酯-氯仿-丙酮〔2：2：1〕200ml中為展開劑，展開后，氨薰后，置紫外光燈下〔365nm〕下檢視。72編輯ppt4．HPLC法：ChP和USP〔25〕采用HPLC法鑒別鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西霉素、鹽酸金霉素等。在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保存時(shí)間應(yīng)與對照品主峰的保存時(shí)間一致。73編輯ppt三、特殊雜質(zhì)檢查1．有關(guān)物質(zhì)：四環(huán)素類中的有關(guān)物質(zhì)主要是異構(gòu)體雜質(zhì)、降解雜質(zhì)〔ETC、ATC、EATC〕等。2．雜質(zhì)吸收度：如ChP規(guī)定的鹽酸四環(huán)素的雜質(zhì)吸收度測定方法如下：取本品加0.8%氫氧化鈉溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照分光光度法，置4cm的吸收池中，在530nm的波長下測定，自加0.8%氫氧化鈉溶液起5min，其吸收度不得過0.12〔供注射用〕。74編輯ppt四、含量測定四環(huán)素類抗生素的含量測定，目前各國藥典多采用HPLC法。例如：鹽酸四環(huán)素的含量測定方法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基鍵合硅膠為填充柱〔pH值適應(yīng)范圍大于8.0〕；0.1mol/L草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氫二銨溶液〔68：27：5〕，用氨試液調(diào)節(jié)pH至8.3為流動相；流速1ml/min；柱溫35℃；檢測波長為280nm。取鹽酸四環(huán)素