分子雜交技術

轉基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測第二部分：分子雜交SouthernBlottingDNA抽提DNA酶切酶切產(chǎn)物電泳轉膜烘膜預雜交探針準備及標記雜交洗膜/顯影1212345679(kb)12335轉基因植物拷貝數(shù)檢測實驗原理HindIIIprobe雜交、顯影不同的插入拷貝產(chǎn)生不同大小的雜交帶HHHH酶切、轉膜1212345679(kb)12335植物總DNA的快速少量抽提（CTAB法）保證核酸一級結構的完整性。（30－50KB）排除其它分子的污染

不存在對工具酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。其它生物大分子的污染應降到最低程度。DNA純化的要求分離純化核酸總的原則CTAB是一種非離子去污劑，CTAB與核酸形成復合物，此復合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復合物再用70－75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。CTAB法原理：操作步驟：采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細粉；

取約0.4g左右細粉于1.5ml離心管，加入1ml預熱至95oC以上的1.5

CTAB，混勻；

65oC水浴中放置30分鐘，每隔5分鐘上下顛倒混合數(shù)次(DNase變性，促進內(nèi)溶物釋放)；

12000rpm離心2分鐘；

吸取600

l上清于新的1.5ml離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），上下顛倒至下層有機相呈深綠色；

12000rpm離心5分鐘；吸取450

l上清于新的1.5ml離心管，加入兩倍體積95％乙醇和1/10體積3MNaAc，輕輕地上下顛倒混勻至絮狀沉淀出現(xiàn)；12000rpm離心10分鐘；棄去上清。用500

l

70％乙醇浸洗沉淀5分鐘，除去離子及CTAB殘余，棄上清,自然干燥；加入50

lTE（含20

g/mlRNaseA），放于4oC溶解；充分溶解后，測定并調(diào)整濃度至250ng/

l（Southern分析常用濃度）；1．盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質多，必須用10mM的β-ME處理2．研缽預凍，粉末轉管前至加CTAB前不要融化3．24:1的苯酚氯仿抽提時動作應輕柔，氯仿的操作要在通風柜中進行4．所用試劑必需滅菌，手套思考：（1）試分析DNA降解的可能原因（2）提高DNA產(chǎn)量的措施本實驗注意事項：

氯仿/異戊醇（24:1）：氯仿是有機溶劑，去除植物色素，蛋白質和多糖等，異戊醇可減少蛋白質變性過程中氣泡的產(chǎn)生，配合使用兩有機溶劑，比用單一有機溶劑去除蛋白質更有效。DNA沉淀：無水或95％的乙醇，異丙醇3MNaAC(或10MNH4AC）協(xié)助乙醇沉淀DNA。75%EtOH去除微量Na+、K+、Mg2+等陽離子及小分子量的有機分子，洗脫CTAB所用到的試劑及作用TE（1mMEDTA，10mMTris.HClpH8.0）溶解并長期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二價陽離子，從而抑制DNase等的活性。1.5×CTAB

CTAB 15g 1MTris·Cl(pH8.0) 75ml 0.5MEDTA 30ml

NaCl 61.4g AddddH2Oto 1000ml

外環(huán)境條件：pH8.0防止脫氨作用；65℃CTAB中DNase變性，促進內(nèi)溶物釋放；離心時>15℃以防CTAB沉淀而降低DNA量。DNA純度：吸光值檢測：檢測260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質，大于1.8說明有RNA。電泳檢測DNA大?。涵傊悄z電泳DNA質量檢測Hoechst33258:可與納克級的DNA結合，而幾乎沒有RNA親和性，激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長460nm。0.1μg/mlHoechst33258適用于檢測500ng/ml的DNA濃度，染料增加到1μg/ml，分析范圍可延至15μg/ml，但會降低一定的靈敏度。缺點：更易于結合AT豐富區(qū)，對DNA組成敏感。EB:與DNA組成無關，但不如Hoechst33258敏感，且能結合RNA，激發(fā)波長302nm，發(fā)射波長590nm。DNA的定量（1）熒光檢測儀1OD＝50

g/ml DS-DNA或

1OD＝40

g/ml RNAorSS－DNA（2.）分光光度計瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。

在pH值為8.0－8.3時，核酸分子帶負電，在電泳時由負極向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構像不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。實驗原理：影響DNA遷移速率的因素

DNA分子大?。哼w移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）瓊脂糖濃度：logU=logU0Kr

膠濃度，U為遷移率，U0

為DNA的自由電泳遷移率，

為膠濃度，Kr為介質阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.DNA構象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm堿基組成與溫度：一般影響不大4-30℃嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強度：影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）實驗步驟：用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；調(diào)整好梳子的高度；稱取0.24g瓊脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫熱時倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；將電泳樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次點入加樣孔中；將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動（注意點樣孔在電泳槽的負極一端）；電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射儀上觀察電泳結果并照相記錄。電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenolblue,Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

1.含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點樣孔中2.含有電泳指示劑，以指示電泳的進程上樣緩沖液：EB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可檢測DNA。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時應注意防護。操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。1000×貯存液(0.5mg/mL)，使用時按1：1000稀釋配制染色液。有特定的識別序列，通常為4－6堿基的回文對稱序列。切割位點位于識別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基團，3’末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)兩種其活性發(fā)揮只需Mg2＋作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點限制酶的一個活性單位（1U）：原則上指在50μl反應體系中，37℃下，經(jīng)過1小時的反應將1μg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在某些極端非標準條件下對底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應條件有關。引起星星活性的主要因素：高濃度的甘油（>5％）；酶過量（>100U/μg）；低離子強度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有機溶劑（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二價陽離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶對上述因素的敏感程度不同氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內(nèi)切酶作用的緩沖體系成分包括：注意注意閱讀商家提供的產(chǎn)品說明書，了解所使用工具酶的濃度和最適作用條件，不要用錯了buffer和作用的溫度等涉及到酶的操作時,一律在冰上操作使用移液器吸取酶時，tip頭只能剛剛插入液面吸取如果有多個反應，酶、buffer、水等應配制成mixture再分裝各種成分加完后應混勻，然后在離心機上短暫離心檢測DNA質量測量DNA濃度所有DNA樣品的濃度調(diào)整到大致相同限制性內(nèi)切酶操作準備：DNA(５

g) 7

l10*bufferreaction 2

lEnzyme(10U) 1

l(10U/l)H2O10

l20

l酶切體系：注意：冰上操作1×5×

DNA 7

lHind(10U/μl) 1

l5

l10×buffer 2

l10

lddH2O10

l 50

l Total20

l37°C酶切過夜酶切體系混勻分裝電泳檢測酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測。若呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則重做。出現(xiàn)切爛：DNA降解，重新提DNA；切不動：雜質多（多糖，蛋白質，酚類，有機溶劑等），重新純化。

酶切效果檢測：A1優(yōu)總DNAA2劣總DNAB1酶切爛B2酶切優(yōu)B3切不動總DNA酶切電泳檢測1212345679(kb)12335酶切反應的終止加入終濃度為12.5mmol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應多數(shù)酶在65°C10分鐘可被不可逆滅活，少數(shù)65°C不失活的酶在75°C15分鐘也能失活若酶對熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不當，酶或DNA加至管壁上，反應體系沒完全混合；混和后應短暫離心；反應條件不合適，用錯了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠DNA不干凈，反應體系中存在酶的抑制劑；DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA樣品中的蛋白質、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性解決辦法：增加酶作用的單位數(shù)（10-20U/μgDNA)增大反應體積以稀釋可能的抑制劑延長反應時間消化基因組DNA時，加入終濃度1-2.5mmol/L多聚陽離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結合帶負電荷的污染物。純化DNA膠濃度0.7-0.8%。膠厚度<5mm(<250ml膠)。膠的均一性(不同樣品的遷移率一致)。樣品DNA量指示劑量稍大，長時間指示。點樣順序：marker，陽性對照，陰性對照，本組樣品電泳電壓：大電泳槽40V，12小時，1-1.5V/cm。電泳結束，指示劑約移動10-11cm。電泳轉膜的方式：

1.UpwardCapillaryTransfer(Figure1) 2.DownwardCapillaryTransfer(Figure2) 3.SimultaneousTransfertoTwoMembranes 4.ElectrophoreticTransfer 5.VacuumTransfer轉膜UpwardCapillaryTransferUpwardCapillaryTransferDownwardCapillaryTransfer尼龍膜：高強度，不易破損，與DNA共價結合，反復使用10次以上不破損，不丟失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效雜交。硝酸纖維素膜：非共價結合，易脆，易丟失DNA，<500bp的DNA無效，不適用于RFLP。

固相支持物的種類及選擇：帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度（SSC），也可選擇0.4NNaOH硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進ＤＮＡ與膜結合（２０×ＳＳＣ），低鹽離子強度導致小片段ＤＮＡ在轉移過程中丟失,pＨ>９，ＤＮＡ不能與膜結合。轉移緩沖液（transferbuffer）DNA轉移的效率較難判斷，只有在轉膜結束后，通過EB染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應嚴格操作轉膜時間（durationoftransfer，12hrs）取決于毛細吸附系統(tǒng)膠厚度(<5mm)及濃度(<1%)ＤＮＡ大小：ＤＮＡ分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減?。模危?，堿轉２hrs大部分結合到膜。尼龍膜（帶正電荷的）具有較大的DNA結合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸能夠不可逆結合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能(無論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復利用10次以上次），經(jīng)毛細吸附作用，把DNA從凝膠上轉到膜上。DNA轉到膜上是復制膠上的帶型，再在80-100℃真空干燥2hrs，即可固定DNA。操作步驟制膠：注意瓊脂糖的質量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml0.8%瓊脂糖凝膠；制樣，點樣：DNA樣品中指示劑量稍多電泳：一般1-1.5V/cm的電壓，使DNA遷移到適當距離，一般指示劑約移動10-11cm(大電泳槽：40V×12-15hrs，小電泳槽30V×4-5hrs)（一）0.8%瓊脂糖電泳（二）轉膜前的準備

每組2個合適大小的水盤1根玻璃棒，1塊鏟膠板，1個切膠刀2張搭鹽橋的濾紙（13cm×35cm)1張合適大小的尼龍膜(7cm×10cm)2張比尼龍膜稍大的濾紙(7.5cm×10.5cm)一疊5cm左右厚的吸水紙(8cm×11cm)1大1小2塊玻璃板試劑：堿轉移：0.4MNaOH,0.2NHCl

鹽轉移：0.125MHCl;1.5MNaCl/0.5MNaOH1.5MNaCl/0.5MTris;20×SSC鹽轉移1凝膠的預處理:電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右上角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號把凝膠翻面，放入加有足量的0.125M的HCl玻璃盤中，輕輕搖動約10min，使電泳指示劑溴酚藍變?yōu)辄S色為止（脫嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠倒去蒸餾水，加入足量變性緩沖液（NaOH/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動變性30min。倒去變性緩沖液，加蒸餾水漂洗倒去蒸餾水，加入足量的中和緩沖液（Tris/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動30min中和。倒去中和液，蒸餾水漂洗20×SSC中平衡10min以上2另一玻璃盤中加入足量的轉膜緩沖液(20×SSC)，放上洗凈的玻璃板，用2-3張濾紙放在玻璃板上，兩端浸入轉膜液中搭制鹽橋（注意濾紙之間不能有氣泡）3在鹽橋濾紙上灑些轉膜液，立即將膠放在鹽橋上（注意凝膠與鹽橋之間不要有氣泡），膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（即放置吸水紙與鹽橋相接）4小心將膜覆蓋在凝膠上（膜可以先用H2O浸濕，再放到20×SSC中平衡，膜與凝膠之間不要有氣泡，要求一次成功，膜一旦貼到凝膠不能移動）5膜上放2張濾紙，濾紙上放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約350g的重物，轉膜過夜注意：

電泳時最好點上約5μl的地高辛標記的marker電泳時DNA的量不要過大，否則部分降解的DNA片段就會與探針雜交引起背景很深電泳時不要將EB加到凝膠或緩沖液中變性和中和步驟中的處理30min可以分成2×15min任何時候操作尼龍膜時都要戴著無塵手套用鑷子接觸膜的邊緣轉膜完畢，將膜小心取下，20×SSC短暫漂息，用兩張濾紙包住膜，置于真空干燥箱中，80℃固定2h或120℃30min用EB染膠以檢測轉移效果（四）烘膜轉膜時嚴禁防短路，不要讓吸水紙全部濕透，重物根據(jù)膜的大小從200g-500g不等面積較小的膜可直接放到膠上，如果尼龍膜較大，可以先在水中浸濕再放入20×SSC平衡，轉膜后2×SSC短暫漂洗尼龍膜以免雜交時有背景預雜交及雜交時保證buffer覆蓋膜如果尼龍膜要多次探測，務必保證在任何時候都不要讓尼龍膜干燥試劑1

脫嘌呤試劑（0.125MHCl）：

11mlHCl

989ml蒸餾水混勻（室溫下可放置1個月）2

變性緩沖液(1.5MNaCl,0.5MNaOH)：

87.66gNaCl

20gNaOH加800ml蒸餾水溶解后，定容至1000ml.（室溫下可放置3個月）

3中和緩沖液（1.5MNaCl,0.5MTris）： 87.66gNaCl 60.5gTrizmabase 800ml蒸餾水溶解后，用HCl調(diào)pH至7.5，定容至 1000ml（室溫下可放置3個月）4

轉膜緩沖液：20×SSC 88.23gTri-sodiumcitrate 175.32gNaCl

加800ml蒸餾水溶解，檢查pH在7-8之間，定容至 1000ml.(室溫下可放置3個月)1組：準備濾紙2組：2000ml脫嘌呤試劑（0.125MHCl）, 3組：2000ml變性緩沖液(1.5MNaCl,0.5MNaOH)4-5組：2000ml中和緩沖液（1.5MNaCl,0.5MTris）6-7組：4000ml轉膜緩沖液(20×SSC)對于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的（EB染色），因為大小不等的分子在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)彌散分布，只有借助標記了放射性同位素或其它標記的特定的探針與在凝膠上（膜上）的靶DNA雜交，將DNA帶型直接顯色或轉換成X光片（或磷屏）上直觀的帶型，從而檢測到目標DNA片段的位置和大小。Southernhybridization1212345679(kb)12335膜上許多沒有DNA分子的地方，存在DNA結合點，若不在預雜交時用一些封閉劑結合在這些位點上，加入探針后，探針DNA分子將會結合在這些位點上，導致雜交背景深。預雜交的目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點封閉，從而減少雜交背景。（Denharts，鮭精DNA含在雜交液中）。預雜交5×SSC(NaCl，檸檬酸鈉)50mMPB(NaH2PO4，Na2HPO4)5×Denhardt(多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)2.5mmEDTA（有/無）100ug/mlSSDNA(鮭精DNA)0.1%SDS10%硫酸葡聚糖（dextransulfate）雜交液組成：實驗原理Hi