生化實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)一人類細(xì)胞中巴氏小體的觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康??了解X染色體失活假設(shè)及劑量補(bǔ)償效應(yīng)的機(jī)制。學(xué)習(xí)人類性染色質(zhì)的檢查方法。實(shí)驗(yàn)原理1949年Barr等在雌貓的神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種濃縮小體，而雄貓無(wú)。而且在其他物種的雌性個(gè)體組織細(xì)胞核中都有。因此X染色質(zhì)又稱Barr小體。異固縮的X染色體隨機(jī)失活。?:?胚胎發(fā)育第16天，出現(xiàn)失活；卵子與精子受精后，其中失活的X染色質(zhì)變?yōu)槌Ｈ旧|(zhì)恢復(fù)活性。?:?相關(guān)概念：心劑量補(bǔ)償效應(yīng)：指在xy性別決定的生物中，使性連鎖基因在兩種性別中有相等或近乎相等的有效劑量的遺傳效應(yīng)。主要類型：X染色體的轉(zhuǎn)錄速率不同（果蠅）。2?雌性體細(xì)胞中有一條x染色體是失活的。（人、哺乳類）Lyon假說(shuō)：1961年由Lyon提出，又稱單個(gè)活性X染色體假說(shuō)。正常雌性哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞中，兩條X染色體中只有一條有活性（activationX,Xa），另一條失活（inactivationX,Xi）；失活是隨機(jī)的；失活發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期；4?雜合體雌性在伴性基因的作用上是嵌合體（mosaic）。實(shí)驗(yàn)步驟取口腔上皮細(xì)胞涂于載玻片上，自然干燥甲醇，冰醋酸（3：1）固定15分鐘，干燥 依次放入95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇，蒸餾水中，每次2-3分鐘 5NHcl分化5秒鐘蒸餾水漂洗3次，每次2-3分鐘硫堇染色10分鐘沖洗干凈，電吹風(fēng)吹干鏡檢（油鏡）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察X染色質(zhì)的識(shí)別方法：一般位于核膜內(nèi)側(cè)緣，形狀多樣，多為半圓形，三角形。?可計(jì)數(shù)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：a：核較大，輪廓清除完整，無(wú)缺損、皺褶，染色清晰。b：核質(zhì)呈細(xì)網(wǎng)狀或均勻的細(xì)顆粒狀，無(wú)深染大顆粒及細(xì)菌污染?★X—染色質(zhì)的形態(tài)：結(jié)構(gòu)致密的濃染小體，輪廓清楚；大小約1u左右，常附著于核膜邊緣或靠近內(nèi)側(cè)；其形狀有微凸形、三角形、卵形、短棒形及雙球形；實(shí)驗(yàn)二植物染色體組型分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

學(xué)習(xí)并掌握植物染色體組型的方法；了解染色體組型分析的意義。實(shí)驗(yàn)原理：各種生物染色體的數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)都是恒定的。染色體組型，也稱為核型，指一個(gè)個(gè)體或物種的特有的染色體構(gòu)成，包括染色體數(shù)目以及每一條染色體所特有的形態(tài)特征（染色體的長(zhǎng)度、著絲粒的位置、臂比值、隨體的有無(wú)、次級(jí)縊痕的數(shù)目及位置、異染色質(zhì)的分布等）。核型是物種最穩(wěn)定的性狀和標(biāo)志，通常在體細(xì)胞有絲分裂中期時(shí)進(jìn)行核型的分析鑒定，也可利用減數(shù)分裂期的染色體進(jìn)行分析鑒定。染色體組型分析就是通過(guò)對(duì)染色體標(biāo)本和其照片進(jìn)行測(cè)量、對(duì)比分析、配對(duì)、分組、排列，對(duì)各染色體的形態(tài)進(jìn)行分析。在細(xì)胞遺傳學(xué)、現(xiàn)代分類學(xué)、生物進(jìn)化和遺傳育種學(xué)等研究中，是重要的研究手段。發(fā)展歷史1920年提出三項(xiàng)技術(shù)促進(jìn)：低滲處理秋水仙素應(yīng)用植物凝激素應(yīng)用（PHA）染色體分帶技術(shù)：Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶、N帶等FISH技術(shù)（熒光染色體原位雜交技術(shù)）染色體的特征數(shù)目長(zhǎng)度（絕對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度）數(shù)目長(zhǎng)度（絕對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度）2n=？）著絲粒位置 （M\SM\ST\T）隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置帶型分析應(yīng)用意義染色體組型分析iaia染色體水平上的表型可確定物種的特征，確定種屬親緣關(guān)系分析生物物種的變異和進(jìn)化過(guò)程識(shí)別單條染色體、基因定位臨床應(yīng)用（染色體疾病、產(chǎn)前診斷）著絲粒位置 （M\SM\ST\T）隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置帶型分析實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：染色體數(shù)目：一般以體細(xì)胞染色體數(shù)目為準(zhǔn)。染色體絕對(duì)長(zhǎng)度：絕對(duì)長(zhǎng)度（pm）=放大的染色體長(zhǎng)度F放大倍數(shù)染色體組總長(zhǎng)度=該細(xì)胞單倍體全部染色體長(zhǎng)度（包括性染色體）之和相對(duì)長(zhǎng)度（％）=每條染色體長(zhǎng)度十單倍染色體組總長(zhǎng)度X100（精確到0.01）臂比值=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度十短臂長(zhǎng)度（精確到0.01）隨體：帶隨體的染色體用SAT或者“*”標(biāo)記實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥、大麥、玉米、黑麥、蠶豆等。本實(shí)驗(yàn)選用蠶豆（2n=12）。實(shí)驗(yàn)用品：用具：蠶豆有絲分裂中期照片（6x8cm）、剪刀、鑷子、鉛筆、直尺、計(jì)算器、膠水、白紙等實(shí)驗(yàn)步驟1測(cè)量：測(cè)量每條染色體的總長(zhǎng)度及長(zhǎng)臂長(zhǎng)度和短臂長(zhǎng)度。對(duì)于有隨體的染色體，隨體的長(zhǎng)度可以計(jì)入也可以不計(jì)入染色體長(zhǎng)度之內(nèi)，需要注明。每條染色體的著絲粒應(yīng)平分為二，計(jì)入兩條臂長(zhǎng)度之內(nèi)。（單位：mm）。2計(jì)算：根據(jù)測(cè)量結(jié)果，計(jì)算出：相對(duì)長(zhǎng)度=某染色體的長(zhǎng)度/染色體組內(nèi)全部染色體總長(zhǎng)度臂比值=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度（q）/短臂長(zhǎng)度（p）根據(jù)計(jì)算結(jié)果確定染色體類型。配對(duì)：根據(jù)測(cè)量、計(jì)算的數(shù)據(jù)進(jìn)行同源染色體的配對(duì)。排列和剪貼：將配對(duì)的染色體按由大到小的順序進(jìn)行排列并編號(hào)。等長(zhǎng)的染色體短臂長(zhǎng)的排在前面，特殊的染色體（如性染色體）排在最后。排列、剪貼時(shí)，讓各對(duì)染色體的著絲粒排在一條直線上，短臂在上，長(zhǎng)臂在下。完成表格。見實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)表16-2雄果蠅在前肢先端第二節(jié)具有性梳野生型：體色灰，翅膀呈圓卵型，靜止時(shí)平放交叉重疊，長(zhǎng)度約為腹部長(zhǎng)度的兩倍果蠅為雙翅目昆蟲，具完全變態(tài)。果蠅是遺傳學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)及研究的非常好的材料，其優(yōu)點(diǎn)有：容易飼養(yǎng)，生活周期短；繁殖能力較強(qiáng)，利于遺傳學(xué)分析；突變類型多，且便于觀察；染色體數(shù)少；具唾腺染色體等。實(shí)驗(yàn)四植物細(xì)胞微核技術(shù)檢測(cè)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康??1、了解細(xì)胞微核形成的機(jī)理及其形態(tài)特點(diǎn)；2、學(xué)習(xí)植物根尖細(xì)胞的微核檢測(cè)技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)原理?微核（micronucleus）簡(jiǎn)稱MCN，是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的。在細(xì)胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。?一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的，在有絲分裂后期不能向兩極移動(dòng)，所以游離于細(xì)胞質(zhì)中，在間期細(xì)胞核形成時(shí)，即可在它附近看到一到幾個(gè)很小的圓形結(jié)構(gòu)，直徑大約是細(xì)胞直徑的1/20~1/5，這就是微核。微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，因此，微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一，指示染色體或紡錘體的損傷。微核測(cè)試已用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。三、 實(shí)驗(yàn)材料：大蒜、大豆、蠶豆等。四實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、鑷子、載玻片及蓋玻片。五、實(shí)驗(yàn)步驟：1、浸種催芽：將實(shí)驗(yàn)用的蠶豆按所需要量放入盛有自來(lái)水的燒杯中，浸泡24h,此間至少換水兩次。種子吸漲后，經(jīng)36?48h，大部分初生根長(zhǎng)至1?2cm。2、 處理根尖：陽(yáng)性檢測(cè)采用1.0~2.5MCrO3，0.5~1.5MNaN3，150?250mMEMS,對(duì)照用自來(lái)水處理，處理時(shí)間24h。3、 恢復(fù)培養(yǎng)：處理后的根尖用自來(lái)水浸洗3次，每次2-3min，洗凈后在水中恢復(fù)培養(yǎng)24h。4、 固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后棄去固定液，或換入70％酒精中保存。5、 酸解：棄去固定液，用清水漂洗2-3次，吸凈水，加入6M鹽酸，于室溫解離10min，棄去鹽酸，漂洗根尖2-3次，徹底洗凈鹽酸。6、 染色：截下1-2mm長(zhǎng)的根尖，滴加石炭酸品紅染液，染色10min，加蓋玻片，壓片觀察。固定是借助于物理方法或化學(xué)藥劑的作用，迅速透入組織和細(xì)胞將之殺死，并且使其結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物如：蛋白質(zhì)，脂肪，糖類以及核物質(zhì)與細(xì)胞器等，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上盡可能保持生活時(shí)的完整和真實(shí)狀態(tài)，同時(shí)更易于染色，可以較清楚的顯現(xiàn)細(xì)胞在生活時(shí)不易看清的結(jié)構(gòu)。?酸解的作用是去除未固定的蛋白質(zhì),同時(shí)使胞間層的果膠類物質(zhì)解體，細(xì)胞分散而易于觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、 首先在低倍鏡中找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，找到微核。2、 微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。3、每一處理觀察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中含微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)，即為該處理的MCN%。，即微核千分率。污染指標(biāo)（PI）=樣品實(shí)測(cè)MCN%平均值/對(duì)照組（標(biāo)準(zhǔn)水）MCN%平均值植物減數(shù)分裂的觀察、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆栈ǚ勰讣?xì)胞染色體制片技術(shù)；了解減數(shù)分裂各時(shí)期染色體的變化特征二、實(shí)驗(yàn)原理減數(shù)分裂是性母細(xì)胞在形成配子時(shí)發(fā)生的一種特殊的細(xì)胞分裂方式。兩次分裂均包括前期、中期、后期和末期。前期I細(xì)分為細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期等5個(gè)時(shí)期。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及試劑玉米幼穗鑷子、載玻片、蓋玻片、解剖針、吸水紙卡諾氏固定液（95%乙醇：冰乙酸=3：1）丙酸洋紅四、實(shí)驗(yàn)步驟1、取材：選取適宜的小花或小穗是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。玉米：在喇叭口期前一周左右水稻：葉枕距為-2cm-0cm2、固定：12-24h。經(jīng)95%、80%乙醇中各停留 30min后，于70%的乙醇中保存?zhèn)溆谩?、 制片：1%醋酸洋紅染色2min-3min，蓋片。4、 烤片：細(xì)胞質(zhì)顏色減退，使染色體得到充分鮮明的著色。5、 置換：45%的冰醋酸，使細(xì)胞質(zhì)背景顏色變淺。6、 壓片：用拇指均勻用力垂直壓下7、 鏡檢五、注意事項(xiàng)顯微鏡托住底盤拿放轉(zhuǎn)開物鏡拿放玻片顯微鏡不用時(shí)，要把電源電壓調(diào)至最低使用完顯微鏡要登記前期I(prophaseI)1、 細(xì)線期(leptonema)。核內(nèi)出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)如線的染色體，由于染色體在間期已經(jīng)復(fù)制，這是每個(gè)染色體都是由共同的一個(gè)著絲點(diǎn)聯(lián)系的兩條染色單體所組成。2、 偶線期(zygonema)。各同源染色體分別配對(duì)，出現(xiàn)聯(lián)會(huì)現(xiàn)象。2n個(gè)染色體經(jīng)過(guò)聯(lián)會(huì)而成為n對(duì)染色體。各對(duì)染色體的對(duì)應(yīng)部位相互緊密并列，逐漸沿著縱向連結(jié)在一起，這樣聯(lián)會(huì)的一對(duì)同源染色體，稱為二價(jià)體(bivalent)。一般在這時(shí)出現(xiàn)多少個(gè)二價(jià)體，即表示有多少對(duì)同源染色體。根據(jù)電子顯微鏡的觀察，同源染色體經(jīng)過(guò)配對(duì)在偶線期已經(jīng)開始形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體(synaptonemalcomplex)。3、 粗線期(pachynema)。二價(jià)體逐漸縮短加粗，因?yàn)槎r(jià)體實(shí)際上已經(jīng)包含了4條染色單體，故又稱為四合體或四聯(lián)體(tetrad)。在二價(jià)體中一個(gè)染色體的兩條染色單體，互稱為姊妹染色單體；而不同染色體的染色單體，則互稱為非姊妹染色單體。一般認(rèn)為同源染色體的聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成是在粗線期完成的。此時(shí)非姊妹染色單體間出現(xiàn)交換(crossingover)，因而將造成遺傳物質(zhì)的重組。4、 雙線期(diplonema)。四合體繼續(xù)縮短變粗，各個(gè)聯(lián)會(huì)了的二價(jià)體雖因非姊妹染色體相互排斥而松懈，但仍被一二個(gè)至幾個(gè)交叉(chiasmata)聯(lián)結(jié)在一起。這種交叉現(xiàn)象就是非姊妹染色體之間某些片段在粗線期發(fā)生交換的結(jié)果。在電子顯微鏡下觀察，這時(shí)的聯(lián)會(huì)復(fù)合體的橫絲物質(zhì)脫落了，只是在交叉處還未脫落。5、 終變期(diakinesis)。染色體變得更為濃縮和粗短，這是前期I終止的標(biāo)志。這時(shí)可見到交叉向二價(jià)體的兩端移動(dòng)，并且逐漸接近于末端，這一過(guò)程叫做交叉的端化(terminalization)，這時(shí)，每個(gè)二價(jià)體分散在整個(gè)核內(nèi)，可以一一區(qū)分開來(lái)，所以是鑒定染色體數(shù)冃的最好時(shí)期。中期I(metaphaseI)核仁和核膜消失，細(xì)胞質(zhì)里出現(xiàn)紡錘體。紡錘絲和各染色體的著絲點(diǎn)連接。從紡錘體的側(cè)面觀察，各二價(jià)體不是像有絲分裂中期那樣各同源染色體的著絲點(diǎn)整齊的排列在赤道板上，而是分散在赤道板的兩側(cè)，即二價(jià)體中兩個(gè)同源染色體的著絲點(diǎn)是面向相反的兩極的，并且每個(gè)同源染色體的著絲點(diǎn)朝向哪一極是隨機(jī)的。從紡錘體的極面觀察，各二價(jià)體分散排列在赤道板的近旁。這時(shí)也是鑒定染色體數(shù)冃的最好時(shí)期。后期I(anaphaseI)由于受附著在各個(gè)同源染色體著絲點(diǎn)的紡錘絲的牽引，各個(gè)二價(jià)體各自分開，這樣二價(jià)體的二個(gè)同源染色體分別向兩極拉開，每級(jí)只分到每對(duì)同源染色體中的1個(gè)，實(shí)現(xiàn)了2n數(shù)目的減半。這時(shí)每個(gè)染色體還是包含兩條染色單體，因?yàn)樗鼈兊闹z點(diǎn)并沒(méi)有分裂。末期I(telophaseI)染色體移到兩級(jí)后，松散變細(xì)，逐漸形成兩個(gè)子核；同時(shí)細(xì)胞質(zhì)分為兩部分，于是形成兩個(gè)子細(xì)胞，稱為二分體(dyad)。在末期I后大都有一個(gè)短暫停頓時(shí)期，稱為中間期(interkinesis)，相當(dāng)于有絲分裂的間期；但有兩點(diǎn)顯著不同于有絲分裂的間期：一是時(shí)間很短，二是DNA不復(fù)制，所以中間期的前后DNA含量沒(méi)有變化。在很多動(dòng)物中幾乎沒(méi)有中間期，二是在末期I后緊接著就進(jìn)入下一次分裂。前期11(prophaseII)每個(gè)染色體有兩條染色單體，著絲點(diǎn)仍連接在一起，但染色單體彼此散得很開。中期II(metaphaseI)每個(gè)染色體的著絲點(diǎn)整齊的排列在各個(gè)分裂細(xì)胞的赤道板上。著絲點(diǎn)開始分裂。后期11(anaphaseII)著絲點(diǎn)分裂為二，各個(gè)染色單體有紡錘絲分別拉向兩極末期11(telophaseII)拉到兩極的染色體形成新的子核，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)又分為兩部分。這樣經(jīng)過(guò)兩次分裂，形成四個(gè)子細(xì)胞，這稱為四分體(tetrad)或四分抱子(tetraspore)。各細(xì)胞的核里只有最初細(xì)胞的半數(shù)染色體，即從2n減數(shù)為n。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞主要化學(xué)成分的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的存在部位；2、學(xué)習(xí)細(xì)胞內(nèi)主要化學(xué)成分的檢測(cè)方法；3、掌握血涂片的制片方法。實(shí)驗(yàn)原理■根據(jù)不同生物大分子的結(jié)構(gòu)特征，采用不同的染色劑對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行染色，不同的生物大分子被染成不同的顏色，以利于顯示和觀察?！黾?xì)胞的化學(xué)成分■細(xì)胞的組成：無(wú)機(jī)物和有機(jī)物，有機(jī)物主要是四類生物大分子：■多糖■脂肪（脂質(zhì)、膜）■蛋白質(zhì)■核酸實(shí)驗(yàn)用品■1、器材：顯微鏡，酒精燈（或電爐），刀片，小燒杯，剪刀，鑷子，吸管，火柴，解剖針，棉簽，消毒棉球，玻片，染色缸■2、試劑：革蘭氏碘液，甲基綠—派洛寧，食用醋，過(guò)氧化氫，乙醇，丙酮糖類的檢測(cè)與觀察■1、糖類的觀察：糖類是生物有機(jī)體生命活動(dòng)能量的主要來(lái)源?！觯?）淀粉：淀粉幾乎存在于所有綠色植物的多數(shù)組織中，有直鏈和支鏈淀粉之分，直鏈淀粉不溶于冷水，略溶于熱水，遇碘液顯藍(lán)色反應(yīng)，加熱時(shí)藍(lán)色消失，冷卻時(shí)又重新出現(xiàn)。藍(lán)色的產(chǎn)生是由于直鏈淀粉遇碘液形成不穩(wěn)定的化合物——碘化淀粉之故。支鏈淀粉不溶于水，但吸水后膨脹或成糊狀，遇碘呈紫紅色。■糖類的檢測(cè)與觀察馬鈴薯徒手切片，取一薄片放在載玻片上，加一滴革蘭氏碘液，可見標(biāo)本立即染成藍(lán)色。蓋上蓋玻片，置于低倍鏡下觀察，可見在多角形的薄壁細(xì)胞中，有許多橢圓形藍(lán)色的顆粒，即為淀粉。糖類的檢測(cè)與觀察■（2）糖原：廣泛存在于脊椎動(dòng)物和細(xì)菌中，與淀粉在植物中的作用相同，又稱為動(dòng)物淀粉，是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)貯藏能量的多糖類物質(zhì)，人體的糖原主要貯存在肝臟和肌肉組織中。糖原的結(jié)構(gòu)類似于支鏈淀粉，為球形分子，溶于沸水，遇碘呈紅色?？捎眠^(guò)碘酸雪夫試劑反應(yīng)，簡(jiǎn)稱PAS反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)的觀察■2、蛋白質(zhì)的觀察：在生命活動(dòng)中，蛋白質(zhì)是一類極為重要的大分子，幾乎各種生命活動(dòng)無(wú)不與蛋白質(zhì)的存在有關(guān)，蛋白質(zhì)不僅是細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)成分，而且更重要的是：生物專有的催化劑iaia酶是蛋白質(zhì)，因此細(xì)胞的代謝活動(dòng)離不開蛋白質(zhì)，一個(gè)細(xì)胞中約有一萬(wàn)種蛋白質(zhì)，分子的數(shù)量達(dá)一千億個(gè)。蛋白質(zhì)的觀察糊粉粒（也叫蛋白體，呈圓球狀，存在于植物種子子葉和胚乳中，在種子成熟后期形成，萌發(fā)前期消失，它具有動(dòng)物溶酶體性質(zhì)，含多種蛋白水解酶，為貯藏態(tài)蛋白質(zhì)啟動(dòng)所必需。）是存在某些種子胚乳細(xì)胞液泡中的蛋白質(zhì)，由于水分喪失而成蛋白質(zhì)結(jié)晶。若碘液與糊粉粒中的蛋白質(zhì)作用，則呈黃色反應(yīng)。蛋白質(zhì)的觀察先將蓖麻（黃豆、菜豆、豌豆）種子放在40°C下水中浸泡3~4小時(shí)，剝?nèi)ケ吐椋S豆、菜豆、豌豆）種子外殼，做徒手切片。選一薄片于水中浸泡10分鐘，然后取出置于載玻片上，加一滴革蘭氏碘液，蓋上蓋玻片，置于低倍鏡下觀察，可見細(xì)胞中染成黃色的結(jié)晶，即糊粉粒。酶的檢測(cè)與觀察■3、酶的觀察：■（1）唾液淀粉酶：唾液淀粉酶存在于人或高等動(dòng)物的唾液中，能將淀粉分解為麥芽糖。淀粉的消化首先由口腔分泌的唾液淀粉酶進(jìn)行，淀粉遇碘顯藍(lán)色反應(yīng)，而麥芽糖遇碘不顯色。此法可證明唾液中淀粉酶的存在。酶的檢測(cè)與觀察將口漱凈，用吸管滴一滴食用醋在舌頭上，唾液即開始分泌，把消毒棉球含入口中，待棉球濕透后取出，置小燒杯中，用少量水稀釋。酶的檢測(cè)與觀察用刀片刮取煮熟的馬鈴薯少量，分別置于載玻片兩端，一端加稀釋唾液一滴，另一端加水一滴。15~20分鐘后，再分別加碘液一滴，觀察兩端的顏色反應(yīng)有何不同？若將唾液煮沸，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是否與上面的一致？酶的檢測(cè)與觀察■（2）過(guò)氧化氫酶在生物體內(nèi)，細(xì)胞代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化氫。存在于動(dòng)植物組織中的過(guò)氧化氫酶能使過(guò)氧化氫分解，生成水放出氧氣，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。過(guò)氧化氫酶系還能把許多胺類氧化為有色化合物。若用聯(lián)苯胺混合液處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色或棕色產(chǎn)物。核酸的顯示與觀察■4、核酸的顯示的觀察：核酸是生物遺傳信息的載體分子，所有生物均含有核酸，核酸可以分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）。根據(jù)DNA、RNA聚合程度對(duì)堿性染料的親和力不同，用甲基綠一派洛寧對(duì)被觀察細(xì)胞進(jìn)行染色，甲基綠分子有兩個(gè)相對(duì)的正電荷，與聚合程度高的DNA分子有較強(qiáng)的親和力，可使DNA分子染成藍(lán)綠色，而派洛寧分子中僅一個(gè)正電荷，可與低聚分子RNA結(jié)合使其染成紅色。細(xì)胞質(zhì)和核仁被染成紅色（RNA的存在部位），細(xì)胞核被染成藍(lán)色（DNA的存在部位）。核酸的顯示與觀察■（1）洋蔥表皮細(xì)胞DNA、RNA的顯示：撕取洋蔥表皮一小片，置于載玻片上，滴一滴甲基綠—派絡(luò)寧染液，染色時(shí)間30~40分鐘，用吸管吸一滴蒸餾水沖洗，立即用吸水紙吸干（因派洛寧易脫色）。蓋上蓋玻片，鏡檢觀察結(jié)果：細(xì)胞質(zhì)和核仁呈淡紅色或紅色，表示含RNA,而核質(zhì)呈藍(lán)色，表示含有DNA。核酸的顯示與觀察（2）牛蛙血涂片DNA、RNA的顯示：先取蛙血進(jìn)行涂片，室溫晾干；用70%的乙醇固定5?10分鐘，室溫晾干，再用甲基綠—派洛寧染色時(shí)間20分鐘，用蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去片上多余水分（不要吸得過(guò)干），然后在丙酮中沾一下，進(jìn)行分化。觀察結(jié)果：細(xì)胞核呈綠色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色?！龉潭ǖ哪康模菏共牧蟽?nèi)含物保存起來(lái)，且具有一定的硬度，便于染色?！龉潭ǖ淖饔茫嚎焖贇⑺兰?xì)胞，使其結(jié)構(gòu)固定于某一階段不再發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞膜的滲透性實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞膜的滲透性及各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞膜的速度?！鰧?shí)驗(yàn)原理細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)與能量交換的一種選擇性通透屏障，它既能保障細(xì)胞對(duì)基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝廢物的排出和細(xì)胞內(nèi)離子濃度的調(diào)節(jié)，又能使細(xì)胞維持相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)主要有三種途徑：被動(dòng)運(yùn)輸、主動(dòng)運(yùn)輸、和胞吞與胞吐作用。一般認(rèn)為，在簡(jiǎn)單擴(kuò)散的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中，涉及跨膜物質(zhì)溶解在膜脂中，再?gòu)哪ぶ粋?cè)擴(kuò)散到另一側(cè)，最后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)水相中。因此，其通透性主要取決于分子大小和分子的極性。實(shí)驗(yàn)原理■哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核和內(nèi)膜體系，所以紅細(xì)胞的質(zhì)膜是最簡(jiǎn)單最易操作的生物膜。質(zhì)膜是由脂雙層分子和蛋白質(zhì)構(gòu)成的，各種物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)姆绞绞遣煌?，物質(zhì)的通透性是由物質(zhì)本身屬性和膜的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（如脂溶性、分子大小、所帶電荷等）共同決定的；另外物質(zhì)穿膜的通透性還要受到細(xì)胞生理狀態(tài)和環(huán)境條件（如麻醉劑、熱、輻射、pH值、鹽不平衡等）的影響。實(shí)驗(yàn)原理如果將紅細(xì)胞放置在各種溶液中，根據(jù)紅細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)各種溶質(zhì)的滲透性不同，有的溶質(zhì)可滲入，有的溶質(zhì)不能滲入。即使能滲入，速度也有差異?？赏ㄟ^(guò)觀察紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象時(shí)間的不同來(lái)記錄滲入速度。血紅蛋白從紅細(xì)胞中逸出的現(xiàn)象稱為溶血現(xiàn)象。滲入紅細(xì)胞的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞滲透壓，使水進(jìn)入紅細(xì)胞，引起溶血及細(xì)胞膜破裂。此時(shí)光線較容易通過(guò)溶液，使溶液呈現(xiàn)透明即為溶血。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時(shí)間也不同。因此，可通過(guò)溶血現(xiàn)象來(lái)測(cè)量各種物質(zhì)通透性的差別。影響物質(zhì)穿膜的因素.1.脂溶性越大的分子越容易穿膜，物質(zhì)的脂溶性大小是由物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)屬性所決定的，非極性物質(zhì)比極性物質(zhì)更容易溶于脂類物質(zhì)；.2.小分子比大分子容易穿膜，脂溶性與分子大小相比，前者的影響更大一些，小的非極性分子很容易溶于脂雙層，穿膜快；.3.不帶電荷的分子容易穿膜，同樣大小的物質(zhì)分子，電解質(zhì)的穿膜速度要比非電解質(zhì)慢，強(qiáng)電解質(zhì)要比弱電解質(zhì)慢；.4.親水性分子和離子的穿膜要依賴專一性的跨膜蛋白。實(shí)驗(yàn)材料.兔血實(shí)驗(yàn)用品.1、器材：天平，載玻片，滴管，離心管，燒杯，移液管，試管，試管架，10ml量筒。.2、試劑：0.17mol/L氯化鈉，0.17mol/L氯化銨，0.17mol/L醋酸銨，0.12mol/L草酸銨，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L丙酮，0.32mol/L乙醇等。實(shí)驗(yàn)步驟.1、兔血細(xì)胞懸液.取50ml小燒杯一只，加1份兔血和10份0.17mol/L氯化鈉溶液，形成一種不透明的紅色液體，此即稀釋的兔血。實(shí)驗(yàn)步驟.2、低滲溶液.取試管一支，加入10ml蒸餾水，再加入lml稀釋的兔血，注意觀察溶液顏色的變化，由不透明的紅色逐漸澄清，說(shuō)明紅細(xì)胞發(fā)生破裂造成100％紅細(xì)胞溶血，使光線比較容易透過(guò)溶液。實(shí)驗(yàn)步驟.3、兔紅細(xì)胞的滲透性.（1）.取不同的試管4支，分別在試管上貼上編號(hào)1、2、3、4，然后從有對(duì)應(yīng)編號(hào)的試劑瓶中用量同量取溶液10ml，再加入lml稀釋的兔血，輕輕搖動(dòng)，注意顏色有無(wú)變化?有無(wú)溶血現(xiàn)象?為什么?若發(fā)生溶血，記下時(shí)間（自加入稀釋兔血到溶液變成紅色透明澄清所需時(shí)間）。.（2）.取不同的試管4支，分別在試管上貼上編號(hào)5、6、7、8，然后從有對(duì)應(yīng)編號(hào)的試劑瓶中用量同量取溶液10ml，再加入lml稀釋的兔血，輕輕搖動(dòng)，注意顏色有無(wú)變化?有無(wú)溶血現(xiàn)象?為什么?若發(fā)生溶血，記下時(shí)間（自加入稀釋兔血到溶液變成紅色透明澄清所需時(shí)間）。注意事項(xiàng)：1、 離心機(jī)使用時(shí)，要將配平后的離心管對(duì)稱放置在離心機(jī)內(nèi)，禁止未配平就放入離心機(jī)和非對(duì)稱放置離心管。2、 試管中有紅細(xì)胞和測(cè)試溶液時(shí)，不應(yīng)強(qiáng)力搖晃，以免造成人為的紅細(xì)胞破裂。3、 觀察時(shí)可將試管貼靠在書上，若發(fā)生溶血?jiǎng)t文字可清楚地看見，若不發(fā)生溶血?jiǎng)t看不清。.巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象的觀察實(shí)驗(yàn)原理.細(xì)胞吞噬作用原來(lái)是單細(xì)胞動(dòng)物攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法，也是原始防御作用。隨著動(dòng)物界的進(jìn)化，在高等動(dòng)物中，則發(fā)展生成大小兩類吞噬細(xì)胞（即巨噬細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞），專司吞噬作用，成為非特異免役功能的重要組成部分。實(shí)驗(yàn)原理. 巨噬細(xì)胞由骨髓干細(xì)胞分化生成，然后進(jìn)入血液到達(dá)各組織內(nèi)，并進(jìn)一步分化為各種巨噬細(xì)胞。當(dāng)病原微生物或其它異物侵入機(jī)體時(shí)，能招引巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞又有趨化性，能響應(yīng)招引因子的招引，產(chǎn)生活躍的變形運(yùn)動(dòng)，主動(dòng)向病原體和異物移行，在接觸到病原體或異物時(shí)，即伸出偽足，將之包圍并內(nèi)吞入胞質(zhì)，

形成吞噬體，繼而細(xì)胞質(zhì)中的初級(jí)溶酶體與吞噬泡發(fā)生融合，形成吞噬性溶酶體，通過(guò)其中水解酶等作用下，將病原體殺死，消化分解，最后將不能消化的殘?jiān)懦黾?xì)胞外。實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、 通過(guò)對(duì)小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活動(dòng)的觀察，加深理解細(xì)胞吞噬作用的過(guò)程及其意義；■2、 掌握小白鼠腹腔注射給藥和頸椎脫臼處死方法?！?、 通過(guò)對(duì)小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活動(dòng)的觀察，加深理解細(xì)胞吞噬作用的過(guò)程及其意義；■2、 掌握小白鼠腹腔注射給藥和頸椎脫臼處死方法。實(shí)驗(yàn)材料小白鼠，1%雞紅細(xì)胞懸液（取無(wú)污染的雞血1ml,放入盛有4mlAlsever溶液瓶中，混勻置4°C冰箱保存?zhèn)溆?，一周?nèi)使用。使用前加入0.85%生理鹽水以1500r/min離心10min,洗滌兩次，再用生理鹽水配成1%濃度懸液。實(shí)驗(yàn)用品顯微鏡，解剖盤，剪刀，鑷子，離心機(jī)，注射器，吸管，玻片，吸水紙。試劑■（1）0.85%生理鹽水■（2）Alsever溶液■葡萄糖■檸檬酸鈉■檸檬酸■氯化鈉■蒸餾水2.05g0.89g0.05g0.42g100ml調(diào)PH值至7.2,過(guò)濾滅菌或高壓滅菌lOmin，置4°C冰箱保存。0.4g（3）0.4%臺(tái)盼藍(lán)（trypanblue）染液臺(tái)盼藍(lán)染粉0.4g0.85%生理鹽水100ml4）6%淀粉肉湯含臺(tái)盼藍(lán)染液）牛肉膏0.3g蛋白胨1.0g氯化鈉0.5g蒸餾水100ml加熱后加入可溶性淀粉6.0克，促使溶解，再煮沸滅菌，置4C冰箱保存。用時(shí)水浴融化，加入適量臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，使呈藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)步驟■1、在實(shí)驗(yàn)前一天，給小白鼠腹腔注射6%的淀粉肉湯（含臺(tái)盼藍(lán)）1ml。2、 實(shí)驗(yàn)時(shí)，取一只注射過(guò)淀粉肉湯的小白鼠，腹腔注射1%的雞紅細(xì)胞懸液1ml,輕按小白鼠腹部，使懸液分■散。3、 20min后，用頸椎脫臼法處死小白鼠（用右手抓住鼠尾，左手拿一把剪刀或鑷子按住頸椎，右手用力向后拉即可）。實(shí)驗(yàn)步驟4、 將小白鼠置于解剖盤中，把腹部剪開一小口子，把內(nèi)臟推向一側(cè)，用吸管吸取適量的生理鹽水沖洗腹腔，并吸取腹腔液，吸時(shí)一吸一松，以免把內(nèi)臟吸出?！?5、每人取一張干凈載玻片，滴一滴腹腔液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。6、每人取一張干凈載玻片，滴一滴沒(méi)有注射淀粉肉湯的腹腔液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。觀察與結(jié)果■■ 由于細(xì)胞未經(jīng)染色，因此觀察時(shí)視野亮度需要適當(dāng)調(diào)低。巨噬細(xì)胞體積較大，呈圓形或者不規(guī)則形，表面有偽足，胞質(zhì)中含有數(shù)量不等、大小不一的藍(lán)色顆粒，為淀粉顆粒被吞噬后形成的吞噬體。雞紅細(xì)胞為橢圓形、淡黃色，細(xì)胞核也為橢圓形。在顯微鏡下可以觀察到巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的過(guò)程：有的紅細(xì)胞位于巨噬細(xì)胞的表面，有的被部分吞入，有的被完全吞入，形成吞噬泡。有的吞噬泡體積縮小、呈圓形，表明已與溶酶體發(fā)生融合，泡內(nèi)物質(zhì)正被消化分解。植物染色體標(biāo)本的制備與觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、學(xué)習(xí)植物染色體標(biāo)本的制各技術(shù)，字握染色體的計(jì)數(shù)；■2、了解染色體的生物學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)用品■1.材料■洋蔥根尖、蠶豆根尖、豌豆根尖■2.試劑■1．Carnoy固定液■2．0.1％秋水仙素溶液■卡寶品紅染液■配方I■原液A：稱取3g堿性品紅，溶于lOOml70%酒精中（此液可無(wú)限期保存）。■原液B：取10ml原液A,加入90ml15%石炭酸（苯酚）水溶液（兩周內(nèi)使用）。■染色液:55ml原液B加6m1冰醋酸和6ml37%甲醛（此液適用于植物原生質(zhì)體培養(yǎng)中細(xì)胞核和核分裂的染色）。■配方II:■取配方I中的染色液2—10m1，加90一98m145%醋酸和1.8g山梨醇（此液適用于核和染色體的一般形態(tài)觀察，具有廣泛的適用性）。實(shí)驗(yàn)方法■1.取材：切取o.5cm長(zhǎng)的洋蔥根尖部分?！?.預(yù)處理：將切下的根尖浸入o.1%秋水仙素液中，室溫下處理3—4h。也可把根尖浸入小■燒杯內(nèi)的自來(lái)水中，杯內(nèi)加冰兩小塊，在0—4°C冰箱內(nèi)低溫處理24h左右?！?.固定；取出根尖，投入carnoy液中固定2—24h，換入70%酒精，暫時(shí)保存?！??水解；把根尖投入預(yù)熱的58—60Clm01/L熱HCl中，恒溫條件下水解14一15min?！??染色：去HCl，加卡寶品紅幾滴，染色5—10min（也可在冰箱內(nèi)染色12—24h）?！?漂洗：吸去卡寶品紅，用漂洗液換洗2—3次，每次1—2min?！?.酶解；在載玻片上切取根尖著色深的部分，浸入小酒杯內(nèi)1—2滴混合酶液中，室溫下酶解40min左右或在28C溫箱中酶解20min左右。■8.洗滌：吸去酶液，加蒸餾水，用吸管換洗幾次，除去殘留酶液后加入45%醋酸，使組織軟化?！?.壓片：用吸管從醋酸中吸取材料，置干凈載坡片上，材料周圍保留半滴45%醋酸.蓋上蓋玻片，其上放一片吸水紙。左手指壓住吸水紙的左邊，右手指從吸水紙的右端向右方輕輕抹去。再用鉛筆擦頭從蓋片上輕輕敲打，使細(xì)胞均勻散開。鏡檢：把壓好的片子放顯微鏡下，先觀察細(xì)胞分散狀況和中期分裂相的多少，再檢查分裂中期細(xì)胞中的染色體是否完全散開。如若染色體分散不好而難以分辨和計(jì)數(shù)，可取下片子，平放桌面上，用手指隔著吸水紙?jiān)谏w玻片上稍施壓力，如果操作細(xì)心，用力適度，便可很容易得到染色體分散良好的壓片標(biāo)本，供觀察，計(jì)數(shù)和照相用。封存：壓好的片子如果來(lái)不及觀察或照相，必須進(jìn)行暫時(shí)封存。封存時(shí)先在蓋坡片四周各放麥粒大石蠟一塊，然后用燒熱的解剖針迅速熔化石蠟，使蓋片四周嚴(yán)密封閉。封好的片于可放培養(yǎng)皿內(nèi)濕濾紙上的火柴棒支架上，蓋上培養(yǎng)皿，可放冰箱內(nèi)保存2—3天。實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠钏匐x心法分離細(xì)胞器的原理，以及練習(xí)使用差速離心法分離哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核與線粒體。實(shí)驗(yàn)原理用低滲勻漿、超聲破碎或研磨等方法可使細(xì)胞膜破損，形成細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細(xì)胞器和細(xì)胞組分的混合勻漿，再通過(guò)差速離心，即利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開。實(shí)驗(yàn)原理用組織勻漿的方法在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心制備線粒體。在一給定的離心場(chǎng)中，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一段時(shí)間后，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器中最先沉淀的是細(xì)胞核，其次是線粒體，其他更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。實(shí)驗(yàn)原理懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它屬于等滲溶液，比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和酶的活性，有利于分離，此外，該方法中采用的CaCl2有穩(wěn)定核膜的作用。整個(gè)操作應(yīng)注意使樣品保持4°C,避免酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯綠B活性染色法。詹納斯綠B對(duì)線粒體具有專一性的染色，是毒性最小的堿性染料，線粒體被詹納斯綠B染成綠色實(shí)驗(yàn)原理甲苯胺藍(lán)是常用的人工合成染料的一種,屬于醌亞胺染料類,這類染料一般含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán),一個(gè)是胺基,一個(gè)是醌型苯環(huán),來(lái)構(gòu)成色原顯色。染料除有發(fā)色團(tuán)外,還要有能使色原對(duì)組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)即助色團(tuán)。助色團(tuán)能促使染料產(chǎn)生電離成鹽類,幫助發(fā)色團(tuán)對(duì)組織產(chǎn)生染色力,使切片上的組織細(xì)胞著色。甲苯胺藍(lán)不僅含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán),還含有兩個(gè)助色團(tuán),為堿性染料,甲苯胺藍(lán)中的陽(yáng)離子有染色作用,組織細(xì)胞的酸性物質(zhì)與其中的陽(yáng)離子相結(jié)合而被染色?？扇炯?xì)胞核使之呈藍(lán)色；肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈異染性紫紅色，可用于尖銳濕疣的初篩及肥大細(xì)胞的檢測(cè)，例如色素性蕁麻疹。?離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會(huì)以不同的速度沉降。?懸浮在液體中的固相顆粒的運(yùn)動(dòng)速度取決于：?1．重力——液體中的顆粒處在重力場(chǎng)內(nèi)時(shí)，如在一支平穩(wěn)的試管內(nèi)，將會(huì)受到地球的重力的作用而運(yùn)動(dòng)。2．固液相對(duì)密度的差別——相對(duì)密度小于液相的顆粒懸浮在上面，相對(duì)密度大于液相的顆粒則沉淀下來(lái)。?3．顆粒的大小、形狀和密度。?4．沉降介質(zhì)的粘滯力。?介質(zhì)中顆粒沉降的速度取決于離心場(chǎng)G的大小。在離心技術(shù)中，離心場(chǎng)的大小一般用相對(duì)離心力RCF,即重力加速度g(9.8m/s2)的倍數(shù)來(lái)表示。RCF=l.llX10-5n2r其中：r為顆粒到旋轉(zhuǎn)軸的距離，單位是cm；n為離心機(jī)的轉(zhuǎn)速(轉(zhuǎn)/分，r/m，rpm)。差速離心法?差速離心法：從低速到高速逐級(jí)沉淀分離，使較大的顆粒先在較低轉(zhuǎn)速中沉淀，再用較高轉(zhuǎn)速將原先懸浮在上清液中的較小顆粒分離沉淀下來(lái)，從而使各種亞細(xì)胞組分得以分離。但由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心時(shí)是均勻分布于整個(gè)離心介質(zhì)中的，各級(jí)分離得到的第一次沉淀必然不是純的最重顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。?其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清夜與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。?缺點(diǎn)是：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過(guò)大、離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。為確保離心機(jī)的安全運(yùn)轉(zhuǎn)，使用時(shí)必須對(duì)稱放置離心管，且平衡轉(zhuǎn)子?。。?！否則轉(zhuǎn)軸及轉(zhuǎn)子組件可能會(huì)損壞；嚴(yán)重時(shí)轉(zhuǎn)子可能會(huì)停轉(zhuǎn)，造成事故。記得絕對(duì)不可以用目測(cè)來(lái)平衡離心管——而要用天平。?一個(gè)35ml盛滿液體的試管在3000gRCF的加速下旋轉(zhuǎn)，其有效重量要大于一個(gè)大塊頭的成年男子。實(shí)驗(yàn)用品?儀器、用具：高速冷凍離心機(jī)、顯微鏡、天平、玻璃勻漿器、解剖剪刀、燒杯、量筒、離心管、高速離心管、玻璃漏斗、紗布、玻片。?材料：大白鼠?試劑：0.9%生理鹽水、0.25mol/L蔗糖/3mmol/LCaCl2勻漿液、1%甲苯胺藍(lán)溶液、0.02%詹納斯綠B。方法與步驟?一、細(xì)胞核的分離提取1.實(shí)驗(yàn)前大鼠空腹12h，擊頭處死，迅速剖腹取肝，在冰浴的小燒杯中剪成小塊（去除結(jié)締組織），盡快置于冰冷的生理鹽水中，反復(fù)洗滌，盡量除去血液，用濾紙吸去表面的液體。?2.剪碎的肝組織移入玻璃勻漿管中，加入適量勻漿液，進(jìn)行勻漿（注意保持冰浴狀態(tài)），快速勻漿20—30次后，用蔗糖/CaCl2預(yù)濕的用3層紗布過(guò)濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。?3?將裝有濾液的離心管以2500g，4°C離心15min，取上清液，移入高速離心管中，并保存于冰浴中，待分離線粒體用，同時(shí)涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥。?4.收集的沉淀以少量蔗糖/CaCl2溶液重新懸浮，以2500g離心15min，棄上清液。?5?洗滌過(guò)的沉淀以少量溶液重新懸浮，制備成細(xì)胞核懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，做涂片③，自然干燥。?6.①、②、③涂片用1%甲苯胺藍(lán)染色5min，在高倍鏡下觀察。?二、差速離心分離提取線粒體1?將裝有上清液的高速離心管配平衡后，17000g離心20min，棄上清液，收集沉淀。?2.加入0.25mol/L蔗糖/3mmol/LCaCl2溶液1ml,用吸管吹打成懸液，17000g,4C離心20min，將上清液吸入另一試管中，沉淀加入0.1ml蔗糖/CaCl2溶液制成懸液。?3?取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上（涂片④、⑤），各滴一滴0.02%詹納斯綠B染液，染色20min，鏡檢（為利于線粒體的有氧呼吸，不必加蓋玻片）?？梢娪谢钚缘木€粒體進(jìn)行活躍的運(yùn)動(dòng)，并且著色成藍(lán)綠色。注意事項(xiàng)：?1.動(dòng)物材料實(shí)驗(yàn)前可空腹過(guò)夜，以降低肝臟組織中的脂肪含量，便于實(shí)驗(yàn)操作。?2.實(shí)驗(yàn)中必須注意保持細(xì)胞器的完整性，避免過(guò)于劇烈的機(jī)械操作。尤其是線粒體在保持了呼吸氧化功能時(shí)才能經(jīng)活性染色法檢測(cè)。?3.由于核沉淀中可能依然存在大量因?yàn)檎尺B或纏繞而沉淀的線粒體，所以可酌情將步驟4中洗滌核沉淀后離心得到的上清液，與步驟3的上清液合并加以利用。?4.由于線粒體進(jìn)行活性染色法的檢測(cè)，所以樣品制備好后應(yīng)盡快染色，不要放置過(guò)久。?實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞的形態(tài)觀察和大小測(cè)量?實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、進(jìn)一步熟悉顯微鏡的使用方法；?2、觀察各種不同形態(tài)的細(xì)胞，從而對(duì)細(xì)胞的分類、進(jìn)化及分化有所了解。?3、學(xué)習(xí)顯微測(cè)微尺的使用方法，通過(guò)測(cè)微對(duì)細(xì)胞的大小有所了解。?4、掌握生物繪圖的一般方法。?實(shí)驗(yàn)原理?細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，細(xì)胞靠表面接觸外界的信息，并和外界進(jìn)行物質(zhì)交換；細(xì)胞形態(tài)多樣，有球形、橢圓形、扁平形、長(zhǎng)梭形、星形等，其形態(tài)與功能相適應(yīng)。有機(jī)體的每種細(xì)胞都有其特定的尺寸和形態(tài)，這與它們發(fā)揮特定的功能有關(guān)，而一旦細(xì)胞不能保持固有形態(tài)，其功能就會(huì)受到損害，從而會(huì)給有機(jī)體帶來(lái)一系列問(wèn)題。?實(shí)驗(yàn)原理?光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為0.2pm,而細(xì)胞器大部分在0.1pm和10pm之間，所以光學(xué)顯微鏡下可見到一般細(xì)胞器的外部形態(tài)。較大的細(xì)胞器和細(xì)胞核，質(zhì)體等還可見到其細(xì)微結(jié)構(gòu)。??細(xì)胞器往往由特殊物質(zhì)組成，因而可通過(guò)對(duì)特異物質(zhì)的區(qū)別染色把各種結(jié)構(gòu)區(qū)分開來(lái)，每種細(xì)胞器都有特殊的形態(tài)、大小、分布位置及數(shù)目，這也是我們判斷、識(shí)別細(xì)胞器的依據(jù)。而每種細(xì)胞器在不同細(xì)胞、不同發(fā)育時(shí)期和不同生理狀態(tài)下的形態(tài)大小會(huì)有所不同。所以細(xì)胞器的觀察可用來(lái)判斷細(xì)胞的生理狀和發(fā)育情況。?洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞?人口腔上皮細(xì)胞?人的紅細(xì)胞?神經(jīng)細(xì)胞?酵母菌細(xì)胞?實(shí)驗(yàn)用品?1、器材：普通光學(xué)顯微鏡，測(cè)微尺，刀片，剪刀，小鑷子，玻片，擦鏡紙?2、材料：洋蔥，人口腔上皮細(xì)胞，蛙血細(xì)胞涂片，兔血細(xì)胞涂片，酵母菌涂片?3、試劑：碘液，番紅染液，香柏油，二甲苯?顯微測(cè)微尺的基本原理?鏡臺(tái)測(cè)微尺：鏡臺(tái)測(cè)微尺是長(zhǎng)1mm，分成100小格，每小格為10pm,標(biāo)尺的外圍有一黑色的小環(huán)，以便在顯微鏡下尋找標(biāo)尺位置，標(biāo)尺的圓環(huán)上復(fù)有一圓形蓋玻片以作保護(hù)。蓋玻片是用樹膠粘在在玻片上的，因此避免二甲苯與其接觸。鏡臺(tái)測(cè)微尺是顯微長(zhǎng)度測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)，它并不被用來(lái)直接測(cè)量，而是用它來(lái)校正目鏡測(cè)微尺，故其質(zhì)量對(duì)所測(cè)微體影響極大。??目鏡測(cè)微尺：分為線性目鏡測(cè)微尺和網(wǎng)狀目鏡測(cè)微尺。線性目鏡測(cè)微尺是一塊比目鏡筒內(nèi)徑稍小的有標(biāo)尺的圓形玻璃片，標(biāo)尺長(zhǎng)10mm、分為100格（10：100）網(wǎng)狀目鏡測(cè)微尺上有數(shù)個(gè)正方格的網(wǎng)狀刻度，經(jīng)常使用網(wǎng)狀目鏡測(cè)微尺求面積。???物鏡測(cè)微尺?低倍鏡?高倍鏡?調(diào)換物鏡至所需的倍數(shù)，調(diào)節(jié)焦距使至鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻線最清晰。此時(shí)在視野內(nèi)可以同時(shí)看到鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺。移動(dòng)載物臺(tái)將鏡臺(tái)測(cè)微尺標(biāo)尺移至目鏡測(cè)微尺的下方以避免后者標(biāo)尺上的刻度妨礙視線。旋轉(zhuǎn)目鏡使目鏡測(cè)微尺的標(biāo)尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺平行，移動(dòng)載物臺(tái)使鏡臺(tái)測(cè)微尺最左端的刻線與目鏡測(cè)微尺最左端的刻線重迭，讀出目鏡測(cè)微尺最后端刻線鏡臺(tái)測(cè)微尺標(biāo)尺上所在的位置。如目鏡測(cè)微尺右端線不與鏡臺(tái)測(cè)微尺上任何刻線重合時(shí)，讀出前者在所在之鏡臺(tái)測(cè)微尺刻度中所占的分?jǐn)?shù)。移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺再重新使鏡臺(tái)測(cè)微尺左端刻線與目鏡測(cè)微尺左端刻