醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)名詞解釋：結(jié)構(gòu)基因(structuralgenes)：可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA，并轉(zhuǎn)譯成多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。ORF開(kāi)放閱讀框架（openreadingframe，ORF）：是指DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開(kāi)始，到終止密碼為止的一個(gè)連續(xù)編碼。C值(C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。C值矛盾/C值悖論：C值和生物結(jié)構(gòu)或組成的復(fù)雜性不一致的現(xiàn)象。基因組（genome）：是指生物體全套遺傳信息，包括所有基因和基因間的區(qū)域重疊基因是指同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質(zhì)分子。SNP單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism）是由基因組DNA上的單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當(dāng)一部分還直接或間接與個(gè)體的表型差異、對(duì)疾病的易感性或抵抗能力、對(duì)藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。SNP被認(rèn)為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變蛋白質(zhì)組(proteomics):指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律.質(zhì)譜技術(shù)massspectrometry,MS樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核比（m/z）的差異來(lái)分離并確定分子量開(kāi)放閱讀框=ORF基因工程又稱為重組DNA技術(shù)，是指將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板、4種dNTP為底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆轉(zhuǎn)錄作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依賴DNA的DNA聚合酶作用。粘性末端被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端（來(lái)自360問(wèn)答）載體vector指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。多克隆位點(diǎn)載體上具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)（即在載體的其他部位無(wú)這些酶的相同切點(diǎn)）稱為多克隆位點(diǎn)報(bào)告基因（reportergene）：是指處于待測(cè)基因下游并通過(guò)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來(lái)反映上游待測(cè)基因功能的基因，又稱報(bào)道基因。轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞稱謂感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。堿裂解法在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）條件下，用強(qiáng)陽(yáng)離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。核酸變性變性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過(guò)程。核酸復(fù)性質(zhì)粒（plasmid）是指細(xì)菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。質(zhì)?？寺≥d體的主要用途：①用于保存和擴(kuò)增<2Kb目的DNA。②構(gòu)建cDNA文庫(kù)。③目的DNA的測(cè)序。④作為核酸雜交時(shí)的探針來(lái)源。作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備哪些特點(diǎn)？（來(lái)自360問(wèn)答）用作克隆載體的理想質(zhì)粒一般具備下述特點(diǎn)：

①具有松馳型復(fù)制子（如ColE1），復(fù)制子（replicon）是質(zhì)粒自我增殖所必不可少的基本條件，并可協(xié)助維持使每個(gè)細(xì)胞含有一定數(shù)量的質(zhì)?？截?。

②在復(fù)制子外存在幾個(gè)單一的酶切位點(diǎn)（或多克隆位點(diǎn)），以便目的DNA片段插入。

③具有插入失活的篩選標(biāo)記，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性標(biāo)志，如氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）等，以便從平板中直接篩選陽(yáng)性重組子。

④分子量相對(duì)較小和較高的拷貝數(shù)。此外，質(zhì)粒的缺點(diǎn)是容量較小，一般只能接受小于15kb的外來(lái)DNA，插入片段過(guò)大會(huì)導(dǎo)致重組子擴(kuò)增速度減慢，甚至使插入片段失活。主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，其上有復(fù)制子即可。簡(jiǎn)述分子克隆技術(shù)的基本步驟？一、目的基因的獲取二、載體的選擇三、目的基因和載體的酶切與連接四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞五、重組體的篩選和鑒定簡(jiǎn)述藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)的原理？b-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍(lán)白斑篩選）：使用的載體帶有大腸桿菌的DNA短區(qū)段，含有b-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息，這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞讀框，宿主細(xì)胞攜帶編碼b-半乳糖苷酶C端部分序列，雖然宿主和質(zhì)粒的片段各自都沒(méi)有酶活性，但能融為一體，形成具有活性的酶蛋白質(zhì)-b-半乳糖苷酶，這種互補(bǔ)現(xiàn)象叫a互補(bǔ)，在生色物質(zhì)X-gal和IPTG存在下形成藍(lán)色菌落，但在外源基因插入到多克隆位點(diǎn)后，破壞了質(zhì)粒載體b-半乳糖苷基因讀框，不能編碼b-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。如何進(jìn)行基因組DNA的提取、純化和鑒定？生物樣本預(yù)處理：粉碎組織、理解細(xì)胞，DNA釋放、蛋白質(zhì)沉淀降解。分離：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃纏繞法、異丙醇沉淀法。純化：對(duì)基因組DNA粗品通過(guò)透析、層析、電泳（PAG、AGE、PFGE）、選擇性沉淀等方法提取特定DNA片段，并通過(guò)柱層析、有機(jī)溶劑抽提等方法沉淀、洗滌、得到基因組DNA純品。鑒定：濃度鑒定、純度鑒定、完整性鑒定。簡(jiǎn)述寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則？設(shè)計(jì)原則：探針長(zhǎng)度：一般要求在10～50bpG／C含量為40％～60％探針?lè)肿又袘?yīng)避免互補(bǔ)序列避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個(gè)，如GGGG-或-CCCC-5、借助計(jì)算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有哪些特點(diǎn)？理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)檢測(cè)物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低廉4、標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無(wú)干擾。核酸分子雜交的影響因素有哪些？1、探針的選擇；2、探針的標(biāo)記方法；3、探針的濃度；4、雜交反應(yīng)溫度；5、雜交反應(yīng)時(shí)間；6、洗膜溫度；7、雜交液。PCR的原理是什么？PCR體系需具備哪些要素？原理：1、PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過(guò)程，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，由變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2、在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴(kuò)增效率為100%)。如此反復(fù)循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。PCR反應(yīng)體系：模板（template）；引物（primer）；DNA聚合酶（DNApolymerase）；dNTP；PCRbuffer簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的一般方案。1、50ulPCR反應(yīng)體系的組成:樣品DNA0.1～1ug；正鏈引物（25umol/L）1.0ul；負(fù)鏈引物（25umol/L）1.0ul；dNTP（各2.5mmol/L）4.0ul；10×PCR緩沖液5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；TaqDNA聚合酶1～2.5u；蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。2、對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照分別以陽(yáng)性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。3、PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置：94℃30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。4、PCR產(chǎn)物的保存：PCR產(chǎn)物于4℃保存。PCR引物的設(shè)計(jì)原則有哪些？長(zhǎng)度15～30b，過(guò)短特異性降低，過(guò)長(zhǎng)則成本增加，產(chǎn)量也下降。引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右。3、引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)；兩個(gè)引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會(huì)形成引物二聚體。4、引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域同源性小于70%或連續(xù)互補(bǔ)堿基少于8個(gè)。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。5、引物的3′末端與模板DNA一定要配對(duì)。另外3′末端的末位堿基最好選T、G、C，而不選A（引物3′末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異）。6、只要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠，引物的5′末端堿基最多可以有10個(gè)堿基不與模板DNA匹配，并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。TaqMan熒光定量PCR技術(shù)的原理是什么？1、PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，2、3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號(hào)；3、探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來(lái)；4、熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例。有哪些熒光定量PCR技術(shù)？請(qǐng)分別簡(jiǎn)述其要點(diǎn)。熒光染料法：SYBRgreen熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)出任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。熒光探針?lè)?）Taqman技術(shù)：3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號(hào)；探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來(lái)；熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例。LightCycler探針技術(shù)：熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比3）molecularBeacon技術(shù)（分子燈塔法）工作原理：包括發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針和內(nèi)部淬滅的熒光團(tuán)；分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導(dǎo)致熒光淬滅；單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補(bǔ)而與之雜交；探針5’和3’端分離,淬滅劑對(duì)熒光劑的淬滅作用消